一種靈芝三萜酸活性部位及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及靈芝提取物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靈芝三萜酸活性部位及其制備方 法和在制備改善睡眠保健品和鎮(zhèn)靜安神藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 睡眠是人類和高等動物必須的生理過程，是維持體力和健康的基礎(chǔ)。失眠是一種 常見的睡眠障礙，指不能入睡或維持睡眠狀態(tài)。慢性失眠大概影響15%左右的人群，短暫性 失眠每年影響約80%的人群。目前對于失眠的治療以服用人工合成藥物為主，然而合成藥 物存在嚴重的藥物依賴、認知和運動損害、停藥反跳等不良反應(yīng)。因此，亟需尋找發(fā)展安全 有效的鎮(zhèn)靜安神藥物，以突破鎮(zhèn)靜安神藥物和飲食補充劑的發(fā)展瓶頸。
[0003] 靈芝為多孔菌科赤芝[Ganoderma lucidum (Leyss. ex. Fr. ) Karst.]或紫芝 [Ganoderma japonicum(Fr.)Lloyd]的干燥子實體，其性平；味甘，溫。歸心、肝、脾經(jīng)，自古 就有"仙草"、"瑞草"之稱，藥用價值極高，是我國珍貴的菌藻類藥材。我國人民把它作為藥 用已有2000多年的歷史，周朝古籍《列子》一書中就有"朽壤之上，有菌者芝"。靈芝的"安 神"作用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，2005年版《浙江省中藥飲片炮制規(guī)范》和2010年版《中華人 民共和國藥典》均記述了靈芝具有"益氣安神"作用。在靈芝的多種化學成分中，靈芝多糖 和三萜類化合物是其主要功效成分，我國以靈芝多糖的含量來評價靈芝質(zhì)量的好壞；在日 本等國家則以靈芝三萜酸的含量作為鑒定靈芝制品質(zhì)量的標準。
[0004] 現(xiàn)代藥理學關(guān)于靈芝鎮(zhèn)靜安神作用的研究報道并不多見，Wang和Tang等研究了 靈芝提取物對人體的催眠作用（王祥禮，孟昭陽，王翠萍.靈芝菌液治療失眠癥60例[J]. 中國醫(yī)藥學報，2001，16(1) :47-49 ;TANG Wen-bo, GAO Yi-huai, CHEN Guo-liang, et al. A Randomized，double-blind and placebo-controlled study of a Ganoderma Lucidum polysaccharide extract (ganopoly)in neurasthenia [J]. Journal of Medicinal Food，2005, 8(1) :53-58)，Chu等研究證明靈芝子實體水提物可延長戊巴比妥鈉睡眠實驗 中大鼠的睡眠時間，認為靈芝多糖具有苯二氮卓樣作用（Chu Qing-ping，WANG Li-en，Cui Xiang-yu, et al. Extract of Ganoderma lucidum potentiates pentobarbital-induced sleep via a GABAergic mechanism[J]. Pharmacology, Biochemistry and Behavior，2007, 86(4) :693-698) ;Cui等研究發(fā)現(xiàn)靈芝粗多糖80mg/kg能延長大鼠總睡 眠時間和非快速動眼期睡眠時間而不影響慢波睡眠和快速動眼期睡眠時間，大鼠血清、下 丘腦和背側(cè)中縫核的TNF-a水平顯著升高（CUI Xiang-yu，QJI Su-ying，ZHANG Juan，et al.Extract of Ganoderma lucidum prolongs sleep time in rats[J]. Journal of Et hnopharmacology，2012, 139(3) :796-800) D CHO等應(yīng)用放射性配體受體結(jié)合實驗證明靈 芝子實體醇提物對體有中等強度親和力，而水提物對GABAa受體的親和力極弱 (CH0 Sueng-mock, SHIMIZU Makoto, LEE C-justin, et al. Hypnotic effects and binding studies for GABAa and5_HT2c receptors of traditional medicinal plants used in Asia for insomnia [J]. Journal of Pharmacology，2010, 132(1) :225-232);賈薇等研 究發(fā)現(xiàn)靈芝三萜與茯苓提取物有協(xié)同改善睡眠的功能，靈芝多糖卻沒有此藥理作用，其作 用機制并不明確（賈薇，吳岷，張勁松等.靈芝成分改善睡眠功能試驗初探[J].食用 菌學報，2005, 12(3) :43-47)。江海濤等研究發(fā)現(xiàn)靈芝提取物具有改善睡眠的作用，但其 改善睡眠的效果和受試物劑量沒有明顯的線性關(guān)系，且其作用機制及物質(zhì)基礎(chǔ)也不明確 (江海濤，任袁浩，虞蔚巖等.靈芝提取物在睡眠改善中的功能性研究[J].時珍國醫(yī)國 藥，2008, 19(9) :2231-2232);王雨虹、曹素芳等均對靈芝子實體提取物的鎮(zhèn)靜安神作用進 行了研究，但文中均沒有追溯可能的物質(zhì)基礎(chǔ)（王雨虹.靈芝改善睡眠功能的研究[J].山 西醫(yī)藥雜志，2011，40 (9) :878-880;曹素芳，王新瑞，張晨，等.關(guān)于靈芝改善睡眠功能 的研究[J].浙江食用菌，2009, 17 (6) : 52-54)。
[0005] 因此，盡管靈芝是我國珍貴的菌藻類藥材，其"益氣安神"作用已有數(shù)千年的藥用 歷史，但現(xiàn)代藥理學對其相應(yīng)的活性功能成分尚未十分明確，大多的藥理實驗僅停留在原 藥材和粗提物的基礎(chǔ)上，尚無靈芝提取物進一步精制至活性部位并用于制備鎮(zhèn)靜安神保健 品和藥物的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種靈芝三萜酸活性部位及其制備方法和在制備改善睡眠保健品 和鎮(zhèn)靜安神藥物中的應(yīng)用，靈芝三萜酸活性部位通過復(fù)合酶酶解，再經(jīng)萃取、分離等步驟即 可得到，可用于制備改善睡眠保健品和鎮(zhèn)靜安神藥物。
[0007] -種靈芝三萜酸活性部位的制備方法，包括以下步驟：
[0008] (1)將靈芝子實體藥材粉碎得到干粉，干粉在水中加入復(fù)合酶酶解，經(jīng)滅酶、冷卻、 抽濾，得到酶解液；
[0009] (2)將步驟（1)中得到的酶解液加入石油醚萃取除脂，然后將除脂后的酶解液繼 續(xù)加入乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位，揮干乙酸乙酯層溶劑，得靈芝乙酸乙酯提取 物；
[0010] (3)將步驟⑵制備的靈芝乙酸乙酯提取物溶于乙酸乙酯，先堿化至pH 9~10， 再水洗至中性，得到堿化水層，然后將堿化水層酸化至pH 2~3,再通過乙酸乙酯萃取得粗 靈芝酸；
[0011] (4)將步驟（3)制備的粗靈芝酸，經(jīng)硅膠柱分離，用氯仿和甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，收 集洗脫液，經(jīng)薄層色譜檢識、過濾、蒸干，即得靈芝三萜酸活性部位。
[0012] 本發(fā)明中，通過復(fù)合酶的酶解以及各提取步驟的配合，能更加充分、全面地提取靈 芝中三萜酸類的化合物，靈芝三萜酸活性部位具有較好的鎮(zhèn)靜安神活性。
[0013] 以下作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案：
[0014] 步驟（1)中，將靈芝子實體藥材粉碎得到干粉，包括：先取靈芝子實體藥材， 55°C~75°C干燥，粉碎，過80~120目篩得干粉；進一步優(yōu)選，包括：先取靈芝子實體藥材， 65°C干燥，粉碎，過100目篩得干粉。
[0015] 所述的復(fù)合酶，由以下重量百分含量的組分組成：
[0016] 中性蛋白酶 5%~95%;
[0017] 纖維素酶 2. 5%~48%;
[0018] 果膠酶 2. 5%~48%。
[0019] 進一步優(yōu)選，所述的復(fù)合酶，由以下重量百分含量的組分組成：
[0020] 中性蛋白酶 30 %~80 %;
[0021] 纖維素酶 10 %~35 %;
[0022] 果膠酶 10 % ~35%。
[0023] 植物細胞壁的主要成分是果膠和纖維素，復(fù)合酶中的果膠酶可以酶解其中的果 膠，纖維素酶酶解其中的纖維素，使植物細胞中的有效成分釋放，中性蛋白酶可對其中的蛋 白質(zhì)等大分子物質(zhì)進行澄清處理，從而提高有效成分的得率。復(fù)合酶的使用可以縮短靈芝 三萜酸的提取時間并提高其得率，同時能更加充分、全面地提取靈芝中三萜酸類的化合物， 靈芝三萜酸活性部位具有較好的鎮(zhèn)靜安神活性。
[0024] 所述的復(fù)合酶的加入量為干粉質(zhì)量的1. 0%~5. 0%。
[0025] 所述的水與干粉的料液比為IOmL~30mL :lg，進一步優(yōu)選為20mL :lg。
[0026]所述的酶解條件為：溫度35~70°C、pH3. 5~7、酶解時間4. 5~8h。
[0027] 步驟（3)中，靈芝乙酸乙酯提取物先堿化，將其中的三萜酸成鹽，溶