. 01
[0112] (四）肝組織病理學(xué)觀察
[0113] 肉眼觀察：空白對照組大鼠肝臟色澤鮮艷，質(zhì)軟而韌，邊緣銳利且各肝小葉間無粘 連。模型組大鼠肝臟黃褐色，暗紅色，或紅褐色，質(zhì)地硬較脆，邊緣圓鈍，體積增大，表面附有 蒼白色黏膜，與周圍臟器粘連較嚴(yán)重，并伴有大面積點，片狀壞死區(qū)域。黃芩給藥組肝臟顏 色轉(zhuǎn)淺，輕微質(zhì)韌，小結(jié)節(jié)或小顆粒減少，狀態(tài)介于空白組和模型組之間。
[0114] 肝臟光鏡觀察：正常組（圖1)肝小葉完整、結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射 狀整齊排列，未見到變性或壞死細(xì)胞。CCl 4模型組（圖2)肝小葉結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，被纖 維增生組織間隔形成假小葉，出現(xiàn)肝細(xì)胞大面積的空泡性壞死，脂肪變性嚴(yán)重，匯管區(qū)及小 葉內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤。藥物組（圖3,圖4)較模型組脂肪變性程度減輕，纖維間隔減 少，肝組織病變明顯減輕。
[0115] 二、黃芩對肝腹水大鼠逐水機(jī)制研究
[0116] (一）癥狀與體征的改變
[0117] 造模過程中，100只大鼠死亡25只，除去10只空白，相對死亡率為28 %;根據(jù)模型 評價標(biāo)準(zhǔn)，造模成功的大鼠為33只，相對成模率為51 %。
[0118]根據(jù)模型評價標(biāo)準(zhǔn)，造模后，大鼠的尿量減少，腹圍增加（見表3)，出現(xiàn)腹部膨隆， 皮下有波動感，符合模型評價標(biāo)準(zhǔn)故納入實驗組并隨機(jī)分組實驗。黃芩干預(yù)后，大鼠的尿量 在上升趨勢，腹圍在下降趨勢，波動感減輕。同時，大鼠整體狀態(tài)轉(zhuǎn)好，飲食飲水增加，舌質(zhì) 暗紅程度減輕，淤血點減少，尿液量增多（見表3)色黃減輕，大便發(fā)黑質(zhì)地變軟，甚至出現(xiàn) 便溏，提示其腹水情況得到改善。
[0119] 表3黃芩對肝腹水模型大鼠尿量、腹圍的影響（i±S,n= 6)
[0120]
[0121] 與空白組比較，*P〈0. 05,，〈0. 01 ;與自身給藥前配對比較：aP < 0.05, aaP < 0. 01〇
[0122] (二）黃芩對肝腹水模型大鼠COP和ALB的影響
[0123] 實驗結(jié)果表明，造模后，血漿膠體滲透壓COP降低，血清ALB濃度較正常組顯著降 低，與空白組比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)合腹圍尿量指標(biāo)，符合模型評價標(biāo)準(zhǔn)故納入實 驗組并隨機(jī)分組實驗。當(dāng)給予黃芩干預(yù)后，各給藥組血漿滲透壓COP(表4)，血清ALB(表 4)均有不同程度的升高。
[0124] 表4黃芩對肝腹水模型大鼠COP，ALB的影響（^±s，n= 6)
[0125]
[0126] 與空白組比較，*P〈0. 05, **P〈0. 01 ;與自身給藥前配對比較：aP < 0.05, aaP < 0. 01〇
[0127] (三）黃芩對肝腹水模型大鼠血清TP濃度的測定
[0128] 血清TP是COP的主要物質(zhì)，因此，對TP的測定有利于解釋膠體滲透壓變化的原 因。實驗結(jié)果表明，模型組大鼠的血清TP濃度（63. 1± 3. 19)較空白對照組（46. 27 ±4. 28) 顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈〇. 05);黃芩低劑量干預(yù)后，血清TP濃度（55. 8±5. 22)升 高，與模型組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈〇. 05)，高劑量組血清TP (54. 40±3. 60)顯著升高，與 模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈〇. 01，圖5)。
[0129] (四）黃芩對肝腹水模型大鼠血清離子水平的影響
[0130] 對血清離子的檢測結(jié)果顯示，肝腹水模型組大鼠血清K+、Na+濃度較正常組明顯降 低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表5, P < 0. 05)，血清Cl-降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義（表5)，提示血 清離子出現(xiàn)紊亂；給藥后，黃芩高劑量組血清K+水平較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (表5，P < 0. 05);黃芩高劑量、低劑量組血清Na+水平較模型組明顯升高，其中黃芩高劑量 組有統(tǒng)計學(xué)意義（表5，P〈0. 01 ;黃芩高低劑量組對Cl的作用未見明顯差異（表5)。提示 黃芩通過改善血清離子紊亂，進(jìn)而調(diào)節(jié)了電解質(zhì)平衡。
[0131] 表5黃芩對肝腹水模型大鼠血清電解質(zhì)水平的影響（$±s，n = 6, mmol/L)
[0132]
[0133] 注：與空白組比較，#P〈0. 05, ##P〈0. 01 ;與模型組比較：*P〈0. 05廣P〈0. 01
[0134] (五）黃芩對肝腹水模型大鼠RASS系統(tǒng)的影響
[0135] 對RASS系統(tǒng)實驗結(jié)果表明，肝腹水模型組大鼠血清SRA較空白對照組顯著升高， 黃芩高、低藥物組干預(yù)后血清SRA水平均降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表6);模型組血漿 Ang II較空白對照組明顯升高，黃芩藥物組干預(yù)后Ang II水平均明顯降低（表6)。
[0136] 表6黃芩對肝腹水膜型大鼠血漿SRA、AngII的影響（i±s:，n = 6, ng/L)
[0139] 注：與空白組比較，#P〈0. 05, ##P〈0. 01 ;與模型組比較：*P〈0. 05廣P〈0. 01
[0140] (六）黃芩對肝腹水黃芩對肝腹水模型大鼠血漿AVP、ET-I的影響
[0141] 實驗結(jié)果表明，模型組大鼠血漿AVP水平較空白對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計 學(xué)意義；黃芩高、低劑量給藥干預(yù)后，血漿AVP濃度均有所降低（表7)。模型組血漿ET-I未 及黃芩各劑量組等ET-I水平未見顯著性改變（表7)。
[0142] 表7黃芩對肝腹水模型大鼠血漿AVP、ET-I的影響（n = 6, ng/L)

[0144]注：與空白組比較，#P〈0. 05, ##P〈0.0 l;與模型組比較：*P〈0. 05廣P〈0.0 l
[0145] (七）黃芩對肝腹水大鼠腎組織V2R、AQP2及膽管AQP4蛋白表達(dá)的影響
[0146] Western blot實驗結(jié)果顯示（如圖6)，模型組腎組織V2R蛋白表達(dá)水平較正常組 明顯升高，黃芩各劑量組V2R蛋白表達(dá)較模型組顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖7, P〈0. 05)。 模型組腎組織AQP2蛋白表達(dá)水平較正常組明顯升高，各藥物組AQP2蛋白表達(dá)水平較模型 組均有不程度的降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖8，P〈0. 05);膽總管AQP4蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，模 型組的蛋白表達(dá)較正常組明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義，黃芩高、中劑量給藥后，AQP4蛋白表達(dá) 較模型組增強(qiáng)，與模型組比較，具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖9, P〈0. 05)。
[0147] (八）黃芩對肝腹水大鼠V2R、AQP2及膽管AQP4mRNA表達(dá)的影響
[0148] 熒光定量實驗采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，既先通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品內(nèi)參基因和目的基 因的真實濃度，之后再用目的基因與內(nèi)參基因的真實濃度做比值，獲得目的基因的相對表 達(dá)量。具體擴(kuò)增曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線見下圖。從擴(kuò)增曲線可以看出，儀器可有效檢 測到待測基因的擴(kuò)增；溶解曲線只有一個單峰，說明引物特異性較好，可以用來進(jìn)行定量實 驗；標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸率均在99.0%以上，說明在待測樣品基因在此濃度范圍內(nèi)，呈線性， 可以進(jìn)行統(tǒng)計分析。
[0149] RT-PCR結(jié)果顯示，模型組腎臟組織V2R-mRNA和AQP2-mRNA相對表達(dá)量較正常組明 顯升高，膽總管AQP4-mRNA相對表達(dá)量較正常組明顯降低，黃芩高、低劑量組腎臟V2R-mRNA 和AQP2-mRNA較模型組降低，其差異有均有統(tǒng)計學(xué)意義；膽總管AQP4-mRNA相對表達(dá)量較模 型組降低，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（如圖10、11、12)。
[0150] 綜上所述，黃芩可能通過以下途徑干預(yù)治療肝硬化腹水，有良好的治療效果：
[0151] 1、黃芩通過修復(fù)肝功損傷（ALT、AST、T-BIL)，改善肝纖維化（HA、LN、PCIII、C IV )， 降低肝臟組織損傷；改善腎功能（Cr，BUN);
[0152] 2、改善低蛋白血癥（ALB、TP)和升高膠體滲透壓（COP);
[0153] 3、上調(diào)膽總管AQP4的表達(dá)，促進(jìn)膽管分泌排泄膽汁，緩解膽汁淤積等因素緩解肝 硬化；
[0154] 4、調(diào)節(jié)電解質(zhì)紊亂，調(diào)節(jié)血管通透性，改善水鈉潴留；
[0155] 5、抑制血管收縮和降低抗利鈉因子：通過抑制RASS，下調(diào)血漿ET-UAng II和血清 SRA濃度，從而抑制AVP的合成及腎臟基底膜遠(yuǎn)端集合管V2R的表達(dá)，使AVP與AVP受體V2R 結(jié)合受到抑制，使得對AVP依賴性AQP2囊泡迀移到管腔膜下的胞漿內(nèi)，主細(xì)胞管腔膜上的 AQP-2數(shù)量相應(yīng)地減少，管腔膜水的通透性也相應(yīng)地降低，減輕水鈉潴留，促進(jìn)尿液排泄。
【主權(quán)項】
1. 黃芩在制備治療肝硬化腹水的藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于黃芩的給藥方式具體為：黃芩600g，第一次 加10倍水煎煮lh，第二次加8倍量水煎煮lh，合并煎液，濃縮干燥，研成細(xì)粉。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于黃芩的給藥劑量為3~12g生藥/Kg。4. 黃芩在制備治療肝功損傷的藥物中的應(yīng)用。5. 黃芩在制備治療肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。6. 黃芩在制備治療肝臟組織損傷的藥物中的應(yīng)用。7. 黃芩在制備治療低蛋白血癥的藥物中的應(yīng)用。8. 黃芩在制備治療膽汁淤積的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】黃芩在制備治療肝硬化腹水的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明涉及黃芩的新用途。本發(fā)明的目的在于提供黃芩的新用途。具體為黃芩在制備治療肝硬化腹水的藥物、肝功損傷的藥物、肝纖維化的藥物、肝臟組織損傷的藥物、低蛋白血癥的藥物、膽汁淤積的藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)代治療方法比較，具有避免了肝性腦病、腎功能損害、低鈉血癥、低鉀或高鉀血癥等電解質(zhì)紊亂等并發(fā)癥，且治療費(fèi)用低廉，使用方法簡單，治療效果理想等優(yōu)點，利于臨床實踐應(yīng)用。本發(fā)明用于治療肝硬化腹水。
【IPC分類】A61P1/16, A61K36/539, A61P7/10, A61P7/00
【公開號】CN105193930
【申請?zhí)枴緾N201510697476
【發(fā)明人】劉樹民, 汪娜, 劉學(xué)偉, 苑藝?yán)? 王洪玉
【申請人】劉樹民
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年10月23日