-Time PCR。擴(kuò)增總體系為 1uL: SYBRR Premi XEX TaqTM (2 X) 5.0uL, PCR ForwardPrimer (10umol/L) 0.2uL，PCR Reverse Primer (lOumol/L) 0.2uL，稀釋的 cDNA 模板 4uL，超純水0.6uL。樣品混合后于定量PCR儀Lightcycler (Roche Light Cycler 480)上反應(yīng)。循環(huán)條件:95°C預(yù)變性30s ;95°C變性5s、60°C退火延伸25s，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析:95°C Os,65°C 15s、95°C Os，熔解曲線是單一峰表明是特異性擴(kuò)增。應(yīng)用滅菌超純水作陰性對(duì)照，每個(gè)模板設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果用相對(duì)定量2 Δ &&方法進(jìn)行分析。
[0036]1.2.4ffestern blotting①蛋白收取:吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌3次；新鮮配制蛋白裂解液(RIPA =PMSF = 100:1)冰上操作，6孔板每孔視細(xì)胞量加入約10uL裂解液，用細(xì)胞刮刮下，吹吸混勻，放置冰上30min ;將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈預(yù)冷的EP管中，4°C，12000Xg離心lOmin，取上清。②蛋白濃度測(cè)定:臨時(shí)配制BCA液(A液:B液=50:1);在96孔板每個(gè)孔內(nèi)加入1uL蛋白液和200uL新鮮配制的BCA液，對(duì)照組加入1uL蛋白裂解液和200uL新鮮配制的BCA液，混勻，37 °C孵育30min ;采用BCA法用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度；剩余蛋白加入loading buffer，95°C加熱5min變性。③SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳:根據(jù)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量灌注不同濃度的分離膠，分離膠凝固之后上面灌注濃縮膠；等量蛋白經(jīng)不連續(xù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，先用80V電壓濃縮膠壓縮，然后用120V分離膠進(jìn)行分離；將蛋白經(jīng)濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，恒流300mA 90min，具體時(shí)間依蛋白相對(duì)分子質(zhì)量而定；將膜根據(jù)條帶分剪之后于封閉液中室溫封閉Ih ;加適量的稀釋至工作濃度的一抗4°C輕搖過(guò)夜；TBST漂洗15minX3次；加適量稀釋至工作濃度的hRP 二抗室溫輕搖Ih ;TBST漂洗15minX3次；用顯影液進(jìn)行顯影，膠片曝光成像；掃描儀掃描成像膠片。
[0037]1.2.5siRNA干擾試驗(yàn)按脂質(zhì)體2000的說(shuō)明書(shū)操作，將脂質(zhì)體2000與H19的siRNA混勻，室溫放置20分鐘后，將其滴入培養(yǎng)有軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，混勻培養(yǎng)。RT-PCR檢測(cè)si RNA的干擾效率。
[0038]1.2.6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染GV303-H19質(zhì)粒及空載體于軟骨細(xì)胞中，real time PCR檢測(cè)其過(guò)表達(dá)情況和轉(zhuǎn)染效率。
[0039]1.2.7Fluorescent In Situhybridizat1n Kit
[0040]1.2.7.1細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞爬片置于24孔板孔底，培養(yǎng)適量細(xì)胞(?6 X 14/孔)。實(shí)驗(yàn)前使細(xì)胞融合度達(dá)到60% -70%。
[0041]1.2.7.2細(xì)胞固定與通透a.【I XPBS】清洗細(xì)胞5min ;b.【4%多聚甲醛】室溫固定1min ；試劑A Pre-hybridizat1n Buffer I X 10mT,X 2避光低溫存儲(chǔ)試劑Bhybridizat1n Buffer IXlOmLXl 試劑C Blocking Solut1n 100X0.3mL 試劑 D DAPI染色液100X 200c.【1XPBS】清洗細(xì)胞5min，共3次；d.每孔加入ImL預(yù)冷的【通透液】，4°C靜置5min ；e.棄去【通透液】后，加入【I XPBS】清洗細(xì)胞5min，3次。
[0042]1.2.7.3.探針檢測(cè)a.每孔加入200uL【預(yù)雜交液】，37°C封閉30min ；b.預(yù)雜交同時(shí)，將【雜交液】在37°C中預(yù)熱；c.避光條件下，把2.5uL 20uM [IncRNA FISH Probe MiX儲(chǔ)存液】或【內(nèi)參FISH Probe MiX儲(chǔ)存液】加入到【雜交液】中；d.棄去每孔細(xì)胞中的【預(yù)雜交液】，加入適量含有探針的【探針雜交液】，避光，37°C雜交過(guò)夜；e.避光，42°C，【洗液I】清洗每孔細(xì)胞3次，每次5min，以降低背景信號(hào)；f.避光，42°C，【洗液II】清洗細(xì)胞I次；g.避光，42°C，【洗液III】清洗細(xì)胞I次；h.避光，【1\卩83】清洗細(xì)胞，室溫51^11。
[0043]1.2.7.4DNA染色a.避光，[DAPI染色液】染色1min ；b.避光，【I XPBS】清洗細(xì)胞3次，每次5min。
[0044]1.2.7.5封片避光條件下，從孔中小心取出細(xì)胞爬片，用封片劑(如指甲油)將其固定于載玻片上，進(jìn)行熒光檢測(cè)。
[0045]二:結(jié)果
[0046]2.1LncRNA H19在DDH軟骨組織中的表達(dá)差異，手術(shù)收集7例DDH軟骨組織和6例股骨頸骨折軟骨組織，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行real time PCR擴(kuò)增，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19在DDH中表達(dá)較股骨頸骨折中明顯降低。提示H19可能與DDH的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0047]2.2FISH檢測(cè)LncRNA H19分布情況紅色熒光標(biāo)記提示H19絕大部分分布在胞質(zhì)中，少量位于核內(nèi)，表明其主要在胞質(zhì)中發(fā)揮細(xì)胞功能。如圖2所示。
[0048]2.3SiRNA干擾H19為了驗(yàn)證設(shè)計(jì)的siRNA對(duì)H19的干擾效率，應(yīng)用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照siRNA，該干擾片段與人的基因沒(méi)有任何同源性，并轉(zhuǎn)染了特異性敲除H19的siRNA片段，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄并通過(guò)real time PCR的方法鑒定其敲減效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)siH19的細(xì)胞組明顯低表達(dá)H19，說(shuō)明該特異性作用于H19的siRNA能夠有效地干擾其靶基因的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0049]2.4轉(zhuǎn)染慢病毒LV-H19促進(jìn)H19的表達(dá)為了驗(yàn)證過(guò)表達(dá)H19的轉(zhuǎn)染效率，我們應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照質(zhì)粒GV303和H19的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染72后，收集細(xì)胞，應(yīng)用realtime PCR擴(kuò)增檢測(cè)H19的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組能夠明顯上調(diào)H19的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0050]2.5敲減H19的促炎作用為了驗(yàn)證H19在DDH患者發(fā)展到骨性關(guān)節(jié)炎中的作用，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染si RNA的方法干擾H19的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組比較，s1-H19組中金屬基質(zhì)蛋白酶MMP3，MMP13表達(dá)增強(qiáng)，二型膠原C0L2A1，S0X-9下調(diào)，和加入炎癥因子刺激組趨勢(shì)一致，說(shuō)明H19在調(diào)控DDH進(jìn)展為骨性關(guān)節(jié)炎過(guò)程中起重要作用，結(jié)果見(jiàn)圖5。
[0051]2.6過(guò)表達(dá)H19的抑制炎癥作用過(guò)表達(dá)H19后檢測(cè)DDH軟骨細(xì)胞中金屬基質(zhì)蛋白酶MMP3，MMP13表達(dá)減弱；二型膠原C0L2A1，S0X-9增強(qiáng)，表明過(guò)表達(dá)H19能緩解DDH進(jìn)展成為骨性關(guān)節(jié)炎，結(jié)果見(jiàn)圖6。
[0052]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.長(zhǎng)鏈非編碼RNAH19在制備治療發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的藥物中的應(yīng)用。2.一種延緩發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良進(jìn)展為骨性關(guān)節(jié)炎的藥物，其特征在于，所述的藥物能夠過(guò)表達(dá)長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19。3.過(guò)表達(dá)長(zhǎng)鏈非編碼RNAH19的質(zhì)粒作為延緩發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良進(jìn)展為骨性關(guān)節(jié)炎的藥物的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的過(guò)表達(dá)長(zhǎng)鏈非編碼RNAH19的質(zhì)粒通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒制得。5.長(zhǎng)鏈非編碼RNAH19作為診斷發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的標(biāo)記物的應(yīng)用。6.長(zhǎng)鏈非編碼RNAH19作為區(qū)分發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良患者軟骨組織和股骨頸骨折患者軟骨組織的標(biāo)記物的應(yīng)用。7.一種區(qū)分發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良患者軟骨組織和股骨頸骨折患者軟骨組織的方法，其特征在于，所述的方法為:通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行real time PCR擴(kuò)增，分析長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19的表達(dá)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及長(zhǎng)鏈非編碼RNA？H19(LncRNA？H19)的一種新用途，即，過(guò)表達(dá)長(zhǎng)鏈非編碼RNA？H19能延緩發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良進(jìn)展為骨性關(guān)節(jié)炎。其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：本發(fā)明對(duì)7例DDH軟骨組織和6例股骨頸骨折軟骨組織研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA？H19在DDH中表達(dá)較股骨頸骨折中明顯降低，H19可能與DDH的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系；敲減H19會(huì)加速DDH進(jìn)展為骨性關(guān)節(jié)炎；轉(zhuǎn)染慢病毒LV-H19可促進(jìn)H19的表達(dá)，過(guò)表達(dá)H19能延緩DDH進(jìn)展為骨性關(guān)節(jié)炎。
【IPC分類】A61K48/00, G01N33/68, A61P19/02, A61K31/7088
【公開(kāi)號(hào)】CN105194690
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510736429
【發(fā)明人】陳曉東, 王成龍, 王暉, 朱俊峰, 沈超, 左斌, 李德, 肖飛
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年11月3日