4中所制備的約0.1mL的原位聚合膠原加入微量離心管中的ImL 2X磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.2)中。8至10分鐘后，將聚合的膠原樣品滴加(一滴)到TEM制備室的小格中(直徑為?2_)。然后棄掉多余樣品，形成薄膜。加入造影劑以用于TEM分析。TEM顯微照片顯示具有清晰條帶的膠原原纖維(圖5)。
[0085]實(shí)施例11。
[0086]證實(shí)抗膠原酶活性
[0087]進(jìn)行該研究以確定可原位聚合的膠原組合物的膠原酶抑制。在測(cè)試前，使作為對(duì)照制品的純膠原原纖維和如實(shí)施例4中所述制備的測(cè)試用膠原溶液聚合，以模擬體內(nèi)的類似條件。在膠原酶降解之前進(jìn)行羥脯氨酸試驗(yàn)，以確保在該研究中使用相同量的膠原。在膠原酶降解后進(jìn)行羥脯氨酸試驗(yàn)以測(cè)量在反應(yīng)后的殘留膠原。
[0088]結(jié)果顯示，相比于標(biāo)準(zhǔn)膠原樣品，含有35mM EDTA的測(cè)試用膠原對(duì)膠原酶降解的耐受性增加約35%。
[0089]實(shí)施例12
[0090]證實(shí)殺菌活件
[0091]進(jìn)行該研究以評(píng)價(jià)可原位聚合膠原組合物的殺菌活性。將如實(shí)施例4中所述制備的可原位聚合膠原的兩個(gè)測(cè)試樣品Lot 0022暴露于金色葡萄球菌。在測(cè)試前使測(cè)試樣品聚合形成支架(scaffold)，從而模擬體內(nèi)類似條件。通過(guò)SEM成像來(lái)評(píng)價(jià)抗微生物效果。將樣品暴露于細(xì)菌溶液(?100CFU/mL)，保持兩天。從細(xì)菌溶液中取出膠原支架，用IX的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，并用定影溶液(0.1M二甲砷酸鹽緩沖液中的2%多聚甲醛和2%戊二醛)處理，并在顯影前用純凈水洗滌。SEM顯微鏡照片清楚地表明不存在細(xì)菌菌落。
[0092]實(shí)施例13。
[0093]原位聚合膠原溶液作為涂層的用途
[0094]用原位聚合膠原溶液涂布五種不同材料。
[0095]1.不銹鋼盤(光滑的以及用50號(hào)粒度和220號(hào)粒度的砂紙磨粗的表面)
[0096]2.鈦骨螺釘
[0097]3.聚丙稀縫線(Prolene)
[0098]4.聚丙烯網(wǎng)(輕型，Bard)
[0099]5.PEEK (聚醚醚酮)骨螺釘(Smith和N印hew)
[0100]粘性可溶性膠原在所有材料上形成厚涂層。將樣品置于培養(yǎng)皿中以聚合并干燥。干燥后，涂層非常薄且透明，并且在一些材料樣品上很難被發(fā)現(xiàn)。
[0101]使用以下方法中的至少一種對(duì)該膜進(jìn)行表征:
[0102]1.亮視野顯微鏡-使用Nikon倒置顯微鏡來(lái)捕捉RPC的透明涂層。該顯微鏡圖像提供了對(duì)涂層厚度的測(cè)量。
[0103]2.掃描電鏡(SEM)-使用SEM(次級(jí)電子)成像來(lái)研究涂層的整體性和品質(zhì)。
[0104]3.FTIR光譜-需要在之前和之后掃描聚合物材料以確定膠原涂層的存在。
[0105]4.滴形分析器-在涂布前和涂布后確定金屬盤的表面能，以確定接觸角/表面能的變化。
[0106]5.穩(wěn)定性測(cè)試-在涂層聚合后，將經(jīng)涂布的材料置于PBS中，并在37°C下培養(yǎng)30天，以確定涂層的穩(wěn)定性。30天后，取出該材料，并進(jìn)行亮視野顯微鏡分析，以確定涂層穩(wěn)定性和厚度。
[0107]結(jié)果顯示，在聚合物縫線和聚合物網(wǎng)上存在光滑且一致的膠原涂層。類似地，拋光的不銹鋼盤被原位聚合膠原溶液有效涂布?？偟膩?lái)說(shuō)，所述原位聚合膠原組合物聚合并粘附于金屬和聚合物材料上，且在37°C被暴露于磷酸鹽緩沖鹽水30天后穩(wěn)定。
[0108]由上述可見，本發(fā)明較好地適用于實(shí)現(xiàn)上述所有目的和目標(biāo)，同時(shí)還帶來(lái)其它本發(fā)明顯而易見且固有的優(yōu)點(diǎn)。
[0109]由于可在不背離本發(fā)明范圍的前提下由本發(fā)明獲得多種可能的實(shí)施方案，應(yīng)理解此處所述或附圖中所示的所有情況都應(yīng)被理解為是說(shuō)明性的，而并非限制性的。
[0110]盡管已顯示并討論了具體的實(shí)施方案，但當(dāng)然可做出各種改變，且本發(fā)明不限于此處所述的部分和步驟的具體形式和排列，除非這些限制被包括在以下權(quán)利要求中。此外，應(yīng)理解具體的特征和亞組合具有實(shí)用性，并可使用，而無(wú)須參照其它特征和亞組合。這被權(quán)利要求所考慮，并落入權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.可注射的酸溶性膠原組合物，其包含: 中性溶液，該中性溶液包含酸溶性膠原、EDTA和多元醇， 其中所述組合物在中性PH下為可注射的，且 其中所述酸溶性膠原在暴露于含離子的流體后即聚合。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物包含濃度為5至70mg/ml的所述酸溶性膠原。3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述酸溶性膠原在所述組合物中的濃度為25至65mg/ml ο4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述酸溶性膠原在所述組合物中的濃度為20至40mg/ml ο5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述m)TA為EDTA二鈉。6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物包含濃度為10至50mM的所述EDTA。7.權(quán)利要求6的組合物，其中EDTA在所述組合物中的濃度為25至40mM。8.權(quán)利要求7的組合物，其中EDTA在所述組合物中的濃度為30至35mM。9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多元醇為糖醇。10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述多元醇為D-甘露醇。11.權(quán)利要求1的組合物，其中該組合物包含濃度為2.5%至4%的所述多元醇。12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述多元醇在組合物中的濃度為3.0%至3.9%。13.權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包含二糖。14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述二糖選自蔗糖和果糖。15.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物通過(guò)27號(hào)針頭或插管是可注射的。16.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物在暴露于所述組織后的10至120秒內(nèi)聚合成凝膠塊。17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述組合物在暴露于所述組織后的10至60秒內(nèi)聚合成凝膠塊。18.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物在暴露于所述組織后的10分鐘內(nèi)形成膠原原纖維基質(zhì)。19.權(quán)利要求18的組合物，其中所述組合物在暴露于所述組織后的5分鐘內(nèi)形成膠原原纖維基質(zhì)。20.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物具有280- 360mmol/kg的滲透壓。21.用于填充軟組織的方法，包括: 向軟組織缺陷中注射酸溶性膠原組合物，所述組合物包含: 包含酸溶性膠原和Η)ΤΑ的中性溶液， 其中所述組合物在中性PH下是可注射的，且 其中所述酸溶性膠原在暴露于組織后即聚合。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述軟組織缺陷選自皺紋、皮膚褶皺、皮膚松弛、皮膚輪廓缺陷、皮膚細(xì)紋、皮膚紋理和皮膚不均。23.權(quán)利要求21的方法，其中所述注射是注入唇部或面部皮膚的軟組織缺陷中。24.權(quán)利要求21的方法，其中所述酸溶性膠原在暴露于所述組織后形成膠原原纖維基質(zhì)，且所述基質(zhì)在所述注射后保持至少4周的耐久性。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述基質(zhì)在所述注射后保持至少12周的耐久性。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述基質(zhì)保持至少6個(gè)月的耐久性。27.權(quán)利要求21的方法，其中所注射的所述組合物產(chǎn)生組織再生。28.權(quán)利要求21的方法，其中所注射的所述組合物與組織的基質(zhì)整合。29.權(quán)利要求21的方法，其中所述酸溶性組合物形成填充軟組織缺陷的膠原原纖維基質(zhì)。30.生物相容性醫(yī)學(xué)植入物，其中所述植入物包含: 由聚合物或金屬組成的植入物，和 覆蓋所述植入物的至少一部分的中性酸溶性膠原組合物涂層， 其中該膠原組合物在所述植入物的表面上固化。31.權(quán)利要求30的植入物，其中所述涂層在所述植入物上保持穩(wěn)定至少30天。32.權(quán)利要求30的植入物，其中所述膠原組合物為權(quán)利要求1的組合物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及可注射的酸溶性膠原組合物，所述組合物包含中性溶液，該中性溶液為酸溶性膠原、EDTA和優(yōu)選的多元醇的中性溶液，其中該組合物在生理pH下是可注射的，且酸溶性膠原在暴露于組織后即聚合。本發(fā)明適用于軟組織填充、促進(jìn)軟組織再生和涂布醫(yī)學(xué)植入物和裝置。
【IPC分類】A61Q90/00, A61K8/65
【公開號(hào)】CN105209005
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480025240
【發(fā)明人】D.P.德沃爾, R.J.布魯克斯, T.伯恩
【申請(qǐng)人】德梅爾有限責(zé)任公司以埃特諾根有限責(zé)任公司名義經(jīng)營(yíng)
【公開日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2014年3月4日
【公告號(hào)】CA2901753A1, EP2964184A1, US20150367029, WO2014138021A1