草分枝桿菌口服納米粒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及草分枝桿菌口服納米粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 草分枝桿菌系多功能免疫增強(qiáng)劑，它的主要成分是滅活的草分枝桿菌，對(duì)人類是 一種非病源性細(xì)菌，主要通過(guò)免疫應(yīng)答反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，從而起到治療的目的。草分 枝桿菌的細(xì)胞壁成分誘導(dǎo)非特異性免疫刺激和放大作用，進(jìn)入人體后，激活了機(jī)體的免疫 系統(tǒng)，達(dá)到治療效果。草分枝桿菌主要可分為體液免疫、細(xì)胞免疫、巨瞻細(xì)胞作用H種方式 (朱慕云等，草分枝桿菌在腫瘤臨床應(yīng)用中的價(jià)值，2008,P357)。對(duì)體液免疫的作用主要體 現(xiàn)在增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞活性，促使效應(yīng)T細(xì)胞分泌B細(xì)胞生長(zhǎng)因子，刺激B細(xì)胞進(jìn)入增殖、分 化階段，最終促進(jìn)特異性抗體形成，臨床表現(xiàn)為血清IgG、IgM滴度的增高。對(duì)細(xì)胞免疫的 作用體現(xiàn)在草分枝桿菌能顯著增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)淋己細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖，促進(jìn)白 細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素4、腫瘤壞死因子、Y干擾素等各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，還可顯著增強(qiáng) 自然殺傷細(xì)胞活性。對(duì)巨瞻細(xì)胞的作用體現(xiàn)在草分枝桿菌能刺激T淋己細(xì)胞，促使其釋放 巨瞻細(xì)胞移動(dòng)抑制因子、巨瞻細(xì)胞凝集因子、巨瞻細(xì)胞趨化因子、促有絲分裂因子等，促進(jìn) 單核2巨瞻細(xì)胞釋放大量氧自由基，促進(jìn)骨髓多能干細(xì)胞和脾粒細(xì)胞及巨瞻細(xì)胞的前體增 殖，增加白細(xì)胞介素1的分泌，最終殺滅病原體。
[0003]目前臨床使用的草分枝桿菌為注射液，商品名為"烏體林斯"，臨床采用深部肌肉 注射給藥。注射后少數(shù)病人可能會(huì)出現(xiàn)疲倦、咳姨較多或發(fā)熱等癥狀，部分患者局部甚至可 能出現(xiàn)肌肉組織壞死，可通過(guò)纖維化進(jìn)行修補(bǔ)，最后形成硬結(jié)，但是愈合后在劇烈運(yùn)動(dòng)過(guò)程 可出現(xiàn)疼痛。其次，與口服藥物相比，注射藥品風(fēng)險(xiǎn)較高，發(fā)生不良反應(yīng)的幾率大，而且對(duì)生 產(chǎn)過(guò)程的控制嚴(yán)格，造成成本較高。因此，有必要開(kāi)發(fā)口服的草分枝桿菌制劑避免上述弊 玉山 乂而。
[0004] 發(fā)明人也嘗試將草分枝桿菌直接制成口服制劑使用，但是發(fā)現(xiàn)并無(wú)預(yù)期的免疫增 強(qiáng)作用。參考現(xiàn)有資料（王運(yùn)芳等，舌下含服烏體林斯治療兒童反復(fù)呼吸道感染，中華兒科 雜志，2000,P179)中提及的舌下含服注射液，利用送種給藥方式藥物能很快被吸收，直接 進(jìn)入血液循環(huán)，并且避免肝臟的首過(guò)效應(yīng)，不過(guò)由于舌下粘膜吸收面積有限，草分枝桿菌用 量劑量較小，而且需要考慮草分枝桿菌對(duì)口腔粘膜的刺激性和藥物本身的異味，因此有必 要開(kāi)發(fā)草分枝桿菌的口服制劑。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，一般的口服制劑會(huì)破壞草分枝桿菌的藥效，造 成上述原因是因?yàn)椴莘种U菌進(jìn)入胃腸道后會(huì)被胃部的消化酶直接分解，因而無(wú)法吸收進(jìn) 入體內(nèi)血液循環(huán)發(fā)揮療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種草分枝桿菌口服納米粒，本發(fā)明納米粒采用 包裹技術(shù)將草分枝桿菌包裹在載體材料內(nèi)部，口服給藥后可W避免胃腸道消化酶對(duì)草分枝 桿菌的降解，在藥物到達(dá)腸道后，通過(guò)腸道淋己結(jié)的吸收，進(jìn)一步被巨瞻細(xì)胞吞并，釋放出 藥物草分枝桿菌達(dá)到治療效果。
[0006] 具體的，本發(fā)明草分枝桿菌口服納米粒是將已滅活的草分枝桿菌制備成平均粒徑 在lOOnm~1ym的口服納米粒。
[0007]納米粒口服后其主要吸收部位在回腸內(nèi)集合淋己結(jié)（P巧er'Spatches,PP)，功 能細(xì)胞為微皺權(quán)細(xì)胞（Micro化IdCells，M細(xì)胞）。納米粒被吞瞻后，通過(guò)囊性轉(zhuǎn)運(yùn)方式轉(zhuǎn) 運(yùn)到M細(xì)胞基底面凹腔釋放出來(lái)，此時(shí)納米?；騑游離狀態(tài)，或W被巨瞻細(xì)胞吞瞻的狀態(tài)， 隨淋己細(xì)胞通過(guò)淋己管從淋己循環(huán)進(jìn)入血液循環(huán)，再分布到各組織器官而發(fā)揮療效。PP的 M細(xì)胞吞瞻在腸道粘膜上皮屏障上打開(kāi)了一個(gè)理想通道，構(gòu)成了納米粒非受體轉(zhuǎn)運(yùn)的主要 生理途徑。在送一過(guò)程中，納米粒是W完整結(jié)構(gòu)形式被淋己結(jié)內(nèi)上皮細(xì)胞（M細(xì)胞）吞瞻， 再被傳遞給抗原遞呈細(xì)胞（APC)，最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，生成大量分泌型免疫球蛋白 A(sIgA)，送有效地避免了胃腸道消化酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解和肝臟對(duì)藥物的首過(guò)效應(yīng)，對(duì)在胃 腸道中不穩(wěn)定藥物和抗癌藥的定向淋己系統(tǒng)有著重要的臨床意義。同時(shí)，胃腸道粘膜組織 對(duì)粒子的吸收有粒徑大小依賴，粒徑較小的納米粒可W更有效地通過(guò)PP組織和其它腸系 淋己組織進(jìn)入血液循環(huán)。
[0008] 本發(fā)明草分枝桿菌口服納米粒的制備方法包括如下步驟：
[0009]A、將載體材料溶于有機(jī)溶劑中，形成有機(jī)相；
[0010] B、將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機(jī)相中，形成初乳；
[0011] C、將初乳逐滴加入水相中，形成復(fù)乳；
[0012] D、揮發(fā)復(fù)乳中的有機(jī)溶劑，離必收集固體物質(zhì)，用蒸傭水洗涂，干燥后即得草分枝 桿菌口服納米粒。
[0013]采用W/0/W復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法來(lái)制備草分枝桿菌口服納米粒，其中中間體載體材料 多選擇疏水性物質(zhì)，步驟A所述載體材料為聚居基己酸、聚乳酸、聚乳酸-居基己酸共聚物、 聚丙帰酸樹(shù)脂II、氨化磯脂醜膽堿，載體材料優(yōu)選聚乳酸-居基己酸共聚物。所述溶劑為甲 醇、丙麗、己酸己醋、二氯甲焼、己酸己醋-二氯甲焼溶液、丙麗-二氯甲焼溶液、丙麗-己醇 溶液，溶劑優(yōu)選為二氯甲焼。
[0014] 所述有機(jī)相是將載體材料溶于溶劑所得，其中，有機(jī)相的溶液濃度為20mg/mL~ 130mg/mL，W30mg/mL最優(yōu)。
[0015] 注：二氯甲焼簡(jiǎn)稱為DCM，聚己帰醇簡(jiǎn)稱為PVA，聚乳酸-居基己酸共聚物簡(jiǎn)稱為 PLGA，聚居基己酸簡(jiǎn)稱為PLG，聚乳酸簡(jiǎn)稱為PLA。
[0016] 為了延長(zhǎng)草分枝桿菌口服納米粒在胃腸道壁或胃腸道特定吸收部位的接觸和轉(zhuǎn) 運(yùn)時(shí)間，從而促進(jìn)納米粒的吸收，外水相采用聚己帰醇PVA等乳化劑或粘附性較強(qiáng)的殼聚 糖等溶液，步驟C所述水相為聚己帰醇水溶液、甲基纖維素水溶液、泊洛沙姆188水溶液、藏 糖水溶液或殼聚糖稀醋酸溶液；水相W殼聚糖稀醋酸溶液最優(yōu)。其中，殼聚糖稀醋酸溶液的 濃度為 2mg/mL~6mg/mL,W3mg/mL最優(yōu)。
[0017] 步驟B所述形成初乳采用下述方法制備；W初乳的粒徑和多分散系數(shù)作為指標(biāo)， 用不同的方法形成初乳，初乳的粒徑小于900nm時(shí)利于復(fù)乳的分散。本發(fā)明宜采用超聲法 或高速剪切分散乳化法制備初乳。W超聲法形成初乳方法最優(yōu)，功率范圍200W~500W，超 聲時(shí)間30s~lOmin，W450W超聲5min最優(yōu)。
[001引 如；
[0019] 采用超聲法制備初乳
[0020] 將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機(jī)相溶液中，超聲形成初乳，再將初乳逐滴加入水 相溶液中，W450W超聲lOmin形成復(fù)乳，150巧m攬拌過(guò)夜使有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，15000巧m 離必30min收集，用蒸傭水洗涂離必3次，真空干燥后即為草分枝桿菌口服納米粒。
[0021] 采用高速剪切分散乳化法制備初乳
[0022] 將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機(jī)相溶液中，高速剪切分散儀2500化pm分散2min 形成初乳，再將初乳逐滴加入水相溶液中，W450W超聲lOmin形成復(fù)乳，150巧m攬拌過(guò)夜使 有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，15000rpm離必30min收集，用蒸傭水洗涂離必3次，真空干燥后即為草 分枝桿菌口服納米粒。
[0023]W初乳的粒徑和多分散系數(shù)作為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)W超聲法形成初乳方法最優(yōu)，功率范 圍200W~500W，超聲時(shí)間30s~lOmin，W450W超聲5min最優(yōu)。
[0024] 步驟C所述形成復(fù)乳采用下述方法制備；W口服納米粒最終產(chǎn)品的粒徑、多分散 系數(shù)和包封率作為指標(biāo)，用不同的方法形成復(fù)乳。口服納米粒的粒徑較小時(shí)，在吞瞻細(xì)胞 的作用下可穿過(guò)腸壁，分布于回腸內(nèi)集合淋己結(jié)、腸系膜淋己結(jié)等免疫器官；多分散系數(shù) 小于0.3時(shí)體系較穩(wěn)定；包封率越大，則可W降低藥物的泄漏。本發(fā)明宜采用超聲法、高 速剪切分散乳化法、高壓均質(zhì)法制備復(fù)乳。W高壓均質(zhì)法形成復(fù)乳方法最優(yōu)，均質(zhì)壓力為 30化ar~ISOObar,循環(huán)次數(shù)為6~12次，最優(yōu)為50化ar循環(huán)9次。
[00巧]女口：
[0026] 采用超聲法制備復(fù)乳
[0027] 將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機(jī)相溶液中，450W超聲5min形成初乳，再將初乳逐 滴加入水相溶液中，W450W超聲lOmin形成復(fù)乳，150巧m攬拌過(guò)夜使有機(jī)溶劑完全揮發(fā)， 1500化pm離必30min收集，用蒸傭水洗涂離必3次，真空干燥后即為草分枝桿菌口服納米 粒。
[0028] 采用高速剪切分散乳化法制備復(fù)乳
[0029] 將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機(jī)相溶液中，450W超聲5min形成初乳，再將初乳逐 滴加入水相溶液中，高速剪切分散儀2500化pm分散5min形成復(fù)乳，150rpm攬拌過(guò)夜使有機(jī) 溶劑完全揮發(fā)，ISOOOrpm離必30min收集，用蒸傭水洗涂離必3次，真空干燥后即為草分枝 桿菌口服納米粒。
[0030] 采用高壓均質(zhì)法制備復(fù)乳
[0031] 將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機(jī)相溶液中，450W超聲5min形成初乳，再將初乳逐 滴加入水相溶液中，高壓均質(zhì)機(jī)30化a