一種口服納米疫苗運(yùn)載體的免疫實(shí)施與檢測(cè)技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于口服疫苗免疫實(shí)施與檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及應(yīng)用pH敏感、耐 水解的高分子在口服免疫過程中加強(qiáng)疫苗保護(hù)、協(xié)助抗原靶向運(yùn)輸與吸收、免疫響應(yīng)水平 的快速檢測(cè)方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 口服疫苗在實(shí)施上相對(duì)于注射免疫更加便捷，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)傷害小。多肽作為抗原 安全、無毒副作用、可設(shè)計(jì)性強(qiáng)。盡管腸道系統(tǒng)分布有豐富的免疫細(xì)胞和組織為口服疫苗的 應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，但由于小腸富含多種水解酶，成為當(dāng)前口服疫苗成功開發(fā)的關(guān)鍵屏障，從 而目前少有口服疫苗成功應(yīng)用的報(bào)道。
[0003] 為了獲得有效被腸粘膜吸收進(jìn)入免疫系統(tǒng)的口服疫苗，本專利發(fā)明了 一種以 PMMMA-PLGA完全包裹抗原、有效"繞行"小腸、靶向pH值較高且水解酶少的大腸的疫苗保護(hù) 性運(yùn)載體的免疫實(shí)施方法，該實(shí)施技術(shù)可在大腸控制釋放PLGA/抗原納米顆粒、促進(jìn)抗原 被細(xì)胞吸收。
[0004] 相對(duì)于傳統(tǒng)的佐劑，該運(yùn)載體外層聚（甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯 酸）（PMMMA)具有pH響應(yīng)能力，在酸性下呈致密疏水狀態(tài)，完全隔離水解酶，保護(hù)疫苗，堿性 下發(fā)生相變，轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水狀態(tài)使PLGA/抗原被釋放。該運(yùn)載體在PLGA包裹技術(shù)上首次采用 表面自由基聚合反應(yīng)，填補(bǔ)了常規(guī)反應(yīng)不能完全包裹內(nèi)核顆粒的缺陷。
[0005] 免疫實(shí)施例米用混和伺料，抽干，殼聚糖（用于中性和喊性時(shí)穩(wěn)定疫苗）浸泡的技 術(shù)，對(duì)受試動(dòng)物羅非魚進(jìn)行投喂，短期內(nèi)激發(fā)羅非魚體內(nèi)形成較高水平的特異性抗體（采 用抗原標(biāo)記技術(shù)和非還原PAGE驗(yàn)證），有效消除病原體（GBS菌），保護(hù)羅非魚天數(shù)達(dá)到210 天以上。結(jié)合活體成像分析，受到PMMMA-PLGA保護(hù)的抗原（FITC)主要分布于免疫相關(guān)的 大腸、腎臟和脾臟，較少在降解酶豐富的肝臟和小腸檢出。
[0006] 在檢測(cè)過程中，首次采用了FITC標(biāo)記抗原應(yīng)用非還原PAGE檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合 物，快速有效地檢測(cè)免疫水平。以其為主體，檢測(cè)技術(shù)還包括基于大腸桿菌胞外-周質(zhì)、胞 內(nèi)抗原表達(dá)系統(tǒng)的快速抗體凝集檢測(cè)、微量抗血清抑菌實(shí)驗(yàn)、免疫保護(hù)及FITC標(biāo)記抗原的 活體成像技術(shù)。
[0007] 該項(xiàng)專利的提出基于上述新型口服疫苗運(yùn)載體的簡(jiǎn)易制備與相應(yīng)成套的免疫實(shí) 施-檢測(cè)技術(shù)方案，提高了口服免疫的成功率，可用于精確快速地鑒定通過口服該疫苗獲 得的免疫水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種以pH敏感、酸性至弱堿條件下抗水解的膜殼層的制備 方法，該膜殼層可包裹內(nèi)核，進(jìn)而以其作為疫苗運(yùn)載體進(jìn)行口服免疫實(shí)施及建立誘導(dǎo)免疫 相關(guān)性能的快速檢測(cè)技術(shù)體系。
[0009] 本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] 以一種pH響應(yīng)的PMMMA膜殼層加強(qiáng)口服疫苗，及相應(yīng)的免疫實(shí)施與免疫水平檢 測(cè)技術(shù)。包括：以PLGA/抗原等具有疏水界面的顆粒體系為基礎(chǔ)，通過表面自由基聚合方 法，獲得在酸性條件下穩(wěn)定、抗酶解的聚（甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸） (PMMMA)膜殼層，用以包裹藥物內(nèi)核加強(qiáng)對(duì)疫苗等藥物的保護(hù)，并旨在加強(qiáng)口服疫苗。該疫 苗投喂方式是與飼料混和，首選通過殼聚糖在偏堿環(huán)境中提供保護(hù)。特定時(shí)期采用檢測(cè)技 術(shù)的優(yōu)化組合鑒定抗體水平，優(yōu)選地，檢測(cè)技術(shù)包括熒光標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物的非還原 PAGE檢測(cè)、大腸桿菌抗原表達(dá)系統(tǒng)的抗體凝集檢測(cè)、微量血清抑菌實(shí)驗(yàn)、免疫保護(hù)及FITC 標(biāo)記抗原的活體成像技術(shù)。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明，所述內(nèi)殼層具有疏水界面，在實(shí)施例中，乳酸-羥基乙酸共聚物 (PLGA)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于抗原的緩釋層。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，所述的pH敏感的聚（甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸） (PMMMA)膜殼層，是通過表面自由基聚合反應(yīng)直接在PLGA外周實(shí)現(xiàn)緊密包裹，該膜殼層在 酸性或中性條件下為致密的疏水層，對(duì)酶催化的水解作用有抵抗作用，并能有效逃逸胃、小 腸中的降解和小腸腸道吸收，在堿性提高的大腸中PMMMA通過相轉(zhuǎn)變呈現(xiàn)親水狀態(tài)，釋放 出可被腸吸收的PLGA/抗原囊泡納米顆粒。該釋放特性實(shí)現(xiàn)疫苗在大腸環(huán)境的釋放與吸 收。優(yōu)選地，所述聚（甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸）（PMMMA)膜殼層是由三 種前體，即甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸形成的共聚物。免疫水平的檢測(cè)以抗 原（FITC)-抗體復(fù)合物的非還原PAGE檢測(cè)方法為主體，整合大腸桿菌抗原表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)菌 凝集檢測(cè)、微量抗血清抑菌檢測(cè)、免疫保護(hù)及FITC標(biāo)記抗原的活體成像檢測(cè)技術(shù)。
[0013] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述內(nèi)核蛋白為蛋白/多肽，優(yōu)選為具有活性的蛋白/ 多肽。更優(yōu)選的，所述抗原蛋白為免疫原性和抗原性的蛋白，例如為B族鏈球菌（GBS)的表 面免疫原性蛋白與環(huán)氧硫蛋白（Trx)的融合蛋白Trx-SIP。
[0014] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述pH敏感PMMMA控釋體系是由如下制備方法獲 得：在含有PLGA/抗原疫苗體系的液相中，依順序先后加入甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯、 甲基丙烯酸，再加入引發(fā)劑和催化劑。更優(yōu)選地，將反應(yīng)溫度控制在40-60°C，pH調(diào)節(jié)至 6. 0-7. 0,在超聲作用下，疏水性較強(qiáng)的甲基丙烯酸甲酯先通過疏水作用吸附至PLGA表面， 進(jìn)而加入具有疏水性的丙烯酸甲酯吸附PLGA，最后在均勻分散的乳液體系中加入親水前體 甲基丙烯酸，以及過硫酸銨（APS)和N，N，N'，N' -四甲基乙二胺（TEMED)，在PLGA表面催化 三個(gè)前體的自由基聚合反應(yīng)，使反應(yīng)得到的線性PMMMA高分子牢固包覆PLGA/抗原。
[0015] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，甲基丙烯酸甲酯：丙烯酸甲酯：甲基丙烯酸體積比 為6-8:2-4:1-2,更優(yōu)選地，體積比為6. 5 :2. 5 :1-2 ;還更優(yōu)選地，體積比為6. 5:2. 5:1或 6. 5:2. 5:2〇
[0016] 本發(fā)明還提供了一種以PMMMA加強(qiáng)內(nèi)核疫苗體系、實(shí)現(xiàn)口服免疫的實(shí)施方法與檢 測(cè)技術(shù)，在一個(gè)實(shí)施例中，包括如下步驟：
[0017] 1)制備包裹所述PLGA/抗原（Trx-SIP)內(nèi)核疫苗體系的pH敏感膜殼層PMMMA，加 強(qiáng)PLGA/抗原疫苗體系。
[0018] 2)增強(qiáng)型疫苗PMMMA-PLGA/Trx-SIP與食物（含飼料）混和，以殼聚糖溶液浸泡， 獲得更穩(wěn)定的食用疫苗體系。
[0019] 3)采用上述食用疫苗體系在動(dòng)物中經(jīng)口免疫。
[0020] 4)抗血清抗體與抗原的免疫反應(yīng)的非還原PAGE檢測(cè)，抗血清菌凝、微量抑菌能力 檢測(cè)，免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，以及活體成像技術(shù)示蹤抗原（FITC標(biāo)記）在主要臟器內(nèi)的分布。
[0021 ] 根據(jù)本發(fā)明，所述步驟1)中，所述抗原為蛋白/多肽，通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種 方法，如乳液中的界面自組裝法將PLGA包裹多肽，制備一級(jí)疫苗體系。pH敏感層PMMMA的制 備方法優(yōu)選為：在含有PLGA/抗原的液相中，以甲基丙烯酸甲酯（MMA)、丙烯酸甲酯（MA)和 甲基丙烯酸（MAA)進(jìn)行自由基聚合反應(yīng)，在PLGA表面制備得到完全包裹PLGA/抗原顆粒的 pH感應(yīng)體系。優(yōu)選的，以過硫酸銨（APS)引發(fā)自由基聚合反應(yīng)。更優(yōu)選的，N，N，N'，N'_四 甲基乙二胺（TEMED)為催化劑。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，所述步驟2)中，該食物飼料是以PMMMA-PLGA/抗原體系與食物/飼 料混和制成。優(yōu)選為：以PMMMA-PLGA/抗原體系與食物在中性或酸性環(huán)境下混和，真空抽干 后，浸泡于殼聚糖溶液（pH〈7.0)后，迅速浸泡于弱堿緩沖液數(shù)秒后適度干燥制成，使疫苗 在食物中得以穩(wěn)定。進(jìn)一步優(yōu)選為：所獲得的食用疫苗經(jīng)過真空干燥或冷凍干燥，充分去除 水分，保護(hù)抗原在儲(chǔ)存中不被迅速水解，從而延長(zhǎng)抗原活性時(shí)間。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，所述步驟3)中，動(dòng)物為具有胃腸道系統(tǒng)的脊椎動(dòng)物。優(yōu)選為：在30 攝氏度的水溫下飼養(yǎng)羅非魚，采用Trx-SIP作為抗原，按步驟1)和2)制備PMMMA-PLGA/ Trx-SIP的飼料疫苗，疫苗分三次投喂硬骨魚類羅非魚，每尾魚每次以20ygTrx-SIP/克 體重的攝入量進(jìn)行投喂，每?jī)纱瓮段怪g間隔1周。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，所述步驟4)中，本發(fā)明針對(duì)PMMMA-PLGA/抗原口服疫苗的施用提供 了一種新的系統(tǒng)檢測(cè)方法。通過非還原PAGE在蛋白/肽處于非還原的狀態(tài)下檢測(cè)抗體對(duì) 抗原（異硫氰酸酯FITC標(biāo)記）的特異性識(shí)別與抗體-抗原復(fù)合物形成，相對(duì)于傳統(tǒng)非還原 凝膠電泳檢測(cè)方法，標(biāo)記的技術(shù)直觀、靈敏度高、抗體對(duì)抗原的特異性結(jié)合未受FITC標(biāo)記 的明顯影響。細(xì)菌凝集檢測(cè)中，采用系列稀釋的抗體分別與大腸桿菌胞內(nèi)、周質(zhì)-胞外空間 抗原表達(dá)體系，及大腸桿菌胞外表達(dá)對(duì)照蛋白體系的菌懸液進(jìn)行混和與凝集檢驗(yàn)，確定抗 血清對(duì)抗原表達(dá)菌的特異性識(shí)別與結(jié)合作用。其后采用微量抑菌實(shí)驗(yàn)，即體積為微升級(jí)的 抗血清與病原菌懸液混和，充分培養(yǎng)，在平板上涂布平板，檢測(cè)菌落形成單位（CFU)。優(yōu)選 的：菌懸液采用生理鹽水，即0. 9%NaCl對(duì)細(xì)菌進(jìn)行懸浮。更優(yōu)選的：混和時(shí)間設(shè)定為48 小時(shí)，包括37°C混和1小時(shí)，4°C混和47小時(shí)，4°C的設(shè)定是為了在離體環(huán)境下充分保持抗體 的活性與結(jié)合抗原的性能；平板優(yōu)選為無抗生素的廣譜細(xì)菌培養(yǎng)平板，例如LB平板；平板 的培養(yǎng)條件優(yōu)化為37°C3天，30°C4天，以達(dá)到充分培養(yǎng)病原菌落的目的。免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)設(shè) 置為抗原投喂組、PMMMA-PLGA/抗原投喂組，和未采取免疫的空白對(duì)照組。優(yōu)選的，采用腹 腔注入法接種病原菌，例如將GBS菌懸液進(jìn)行腹腔注射，接種經(jīng)三次口服免疫的羅非魚，在 210天內(nèi)連續(xù)監(jiān)測(cè)魚的健康狀況，統(tǒng)計(jì)感染比例。活體成像技術(shù)采用熒光示蹤的方法檢測(cè)抗 原（FITC標(biāo)記）在羅非魚主要臟器內(nèi)的分布。優(yōu)選的，采用異硫氰酸酯標(biāo)記抗原Trx-SIP， 按步驟1)和2)制備食用疫苗，對(duì)健康的羅非魚進(jìn)行投喂，進(jìn)食36小時(shí)后進(jìn)行活體成像分 析（附圖1)。此時(shí)疫苗已經(jīng)過完整的消化系統(tǒng)，并處于循環(huán)代謝階段，利于保證結(jié)果的準(zhǔn)確 度。
【附圖說明】：
[0025] 圖1 :活體成像技術(shù)分析PMMMA-PLGA/Trx-SIP靶向性能。投喂疫苗36小時(shí)后檢 測(cè)Trx-SIP(FITC標(biāo)記）在體內(nèi)的分布。參數(shù)：激發(fā)光：500nm;發(fā)射光：530nm。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)