用于長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)釋放人類(lèi)抗體的多層可注射自組裝肽腳手架水凝膠的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)釋放人類(lèi)抗體的多層可注射自組裝肽腳手 架水凝膠
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月14日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/782, 791號(hào)的權(quán)利。上 述申請(qǐng)的全部教導(dǎo)通過(guò)引證在此全部并入本文。 技術(shù)背景
[0003] 由于自20世紀(jì)60年代開(kāi)始，控制釋放主要集中在聚合物水凝膠和動(dòng)物衍生的生 物材料，因此使用水凝膠作為藥物傳遞載體已經(jīng)被研究過(guò)了。但是，由合成聚合物組成的水 凝膠由于以下原因不能代表生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的理想系統(tǒng)：（i)組分和降解產(chǎn)物的毒性（例如， 許多聚合物需要利用有毒的交聯(lián)劑，例如戊二醛，及其他能夠威脅生命的化學(xué)試劑，例如聚 乙醇酸-聚乳酸及其類(lèi)似物，在降解過(guò)程中局部釋放酸），（ii)后凝膠化聚合物膨脹常常會(huì) 導(dǎo)致宿主疼痛，和（iii)由于聚合物網(wǎng)絡(luò)的大孔，活性聚合物在較短的時(shí)間內(nèi)釋放。
[0004] 而且，在實(shí)際涉及人體的臨床應(yīng)用中不會(huì)考慮從動(dòng)物體提取的生物聚合物，例如， 膠原蛋白、明膠、纖維蛋白和粘連蛋白t1'2'3'4]，這是由于這些生物聚合物的來(lái)源和具有引發(fā) 宿主對(duì)可能存在于供體組織中的病毒、細(xì)菌及其他未知物質(zhì)的炎癥性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。為了滿(mǎn) 足生物相容性藥物釋放系統(tǒng)的需要，研發(fā)了可生物降解的合成聚合物[ 5'1'2'3]。盡管對(duì)新型 水凝膠系統(tǒng)進(jìn)行了廣泛的研究和持續(xù)的研發(fā)，但是這些挑戰(zhàn)沒(méi)有被完全攻克。
[0005] 之前，研究了由肽ac_(RADA)4_C0NH2 (其中，R是精氨酸，A是丙氨酸并且D是天 冬氨酸）自組裝組成的納米纖維水凝膠對(duì)小模型藥物分子的控制釋放[9]。在近期研究中 已經(jīng)表明，具有不同分子量和等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)可以通過(guò)ac- (RADA) 4-〇)冊(cè)12肽水凝膠緩慢釋 放，并且研究了在3個(gè)月時(shí)間內(nèi)的釋放動(dòng)力學(xué)[ 1(：]。自組裝肽水凝膠是可注射的，這是由于 他們可以在體內(nèi)隨著肽溶液和生物液體的相互作用形成。在被引入電解質(zhì)溶液過(guò)程中，自 組裝肽形成直徑在10納米-20納米之間的納米纖維，這近一步組織形成含水率高達(dá)99. 5 % (重量/體積）的腳手架水凝膠，并且形成的小孔直徑在5納米-200納米之間[n]。肽的凝 膠化不需要有害的材料（例如毒性交聯(lián)劑）來(lái)引發(fā)溶膠-凝膠變化，并且這種水凝膠的降 解產(chǎn)物是天然氨基酸，這種天然氨基酸可以被代謝并被身體重新利用。溶膠-凝膠變化在 生理?xiàng)l件下進(jìn)行的事實(shí)促進(jìn)了肽溶液與生物活性分子的混合，并且以一種組織特異性方式 被共同注射，在組織中形成藥物傳遞載體。根據(jù)分子設(shè)計(jì)，肽腳手架水凝膠是生物相容的， 并且已經(jīng)被用于許多組織工程應(yīng)用，包括骨和軟骨再造、神經(jīng)元的和心臟組織再生、傷口愈 合、血管生成和止血[ 12'13]。自組裝肽水凝膠提供了一種平臺(tái)，該平臺(tái)使其可以理想的用于 各種生物納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用，用于促進(jìn)水凝膠內(nèi)部的細(xì)胞迀移。而且他們是無(wú)毒的、非免疫原性 的、非凝血酶原性的、生物可降解的，并且適合于通過(guò)注射入某一具體組織而進(jìn)行定位治療 由于除了存在復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)之外還存在多種功能性基團(tuán)，大蛋白質(zhì)，例如抗體， 2 比傳統(tǒng)的有機(jī)藥物和無(wú)機(jī)藥物更大并且更為復(fù)雜，因此他們的控制釋放位點(diǎn)制劑更難功 3 克。為了使抗體維持生物活性，該制劑必須在整個(gè)治療期間保護(hù)抗體的功能性。在持續(xù)釋 放期間，由于三維結(jié)構(gòu)的缺失或者化學(xué)不穩(wěn)定性，抗體有多種降解途徑。這些挑戰(zhàn)被治療長(zhǎng) 度弱化。具有治療性質(zhì)的功能性抗體的呈遞對(duì)于持續(xù)傳遞生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用是重要的。因此， 需要開(kāi)發(fā)一種基于生物可降解的肽的持續(xù)釋放系統(tǒng)，從而在延長(zhǎng)的時(shí)間期限內(nèi)傳遞治療有 效性大蛋白質(zhì)，例如，抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明涉及一種用于持續(xù)傳遞治療劑的藥物制劑，所述治療劑優(yōu)選蛋白質(zhì)、多肽、 抗體或者抗體片段，所述藥物制劑包括一種或者一種以上膠體形成肽，其中，所述制劑在至 少2周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少九周、至少十 周、至少十一周、至少十二周或者更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)顯示持續(xù)的傳遞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明涉及一種制劑，所述制劑包括在電解質(zhì)溶液（例如，生物流體和鹽）存在的情況下經(jīng)歷溶 膠-凝膠變化的自組裝肽。所述制劑可以持續(xù)釋放抗體和抗體片段，尤其是IgG。隨著水凝 膠納米纖維密度的增加，抗體的擴(kuò)散率會(huì)減少，從而提供了一種控制釋放動(dòng)力學(xué)的方式。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及多層水凝膠結(jié)構(gòu)，這些多層水凝膠結(jié)構(gòu)包括基本上同心球狀的 補(bǔ)體和結(jié)構(gòu)上相容肽，例如ac- (RADA) 4-〇)順2核心和ac- (KLDL) 3-〇)順2殼。所述治療劑可 以通過(guò)洋蔥樣的體系結(jié)構(gòu)擴(kuò)散，當(dāng)使用補(bǔ)體肽時(shí)可以形成所述洋蔥樣的體系結(jié)構(gòu)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，本發(fā)明的持續(xù)釋放制劑可以在至少兩周、至少三周、至少四周、至少五周、至少 六周、至少七周、至少八周、至少九周、至少十周、至少十一周和至少十二周或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi) 釋放功能上完整的抗體。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述制劑在至少大約2個(gè)月到大約三 個(gè)月的時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放功能上完整的抗體，例如IgG。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種制劑，其中，被釋放的抗體（例如，IgG)的二 級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析以及生物學(xué)分析顯示，即使在水凝膠內(nèi)部?jī)蓚€(gè)或者三個(gè)月之后，密 封和釋放不影響所述抗體的構(gòu)象和他們的生物活性。多克隆人IgG的功能性可以通過(guò)IgG 密封和釋放之后他們與膽堿磷酸抗原的親和性來(lái)確定。所述抗原結(jié)合效率可以被用于確定 密封后功能性的保留度.本發(fā)明涉及一種制劑，其中一種完全生物相容性可注射肽水凝膠 系統(tǒng)可以用于控制釋放應(yīng)用，作為治療劑抗體的載體。
[0010] 在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及人免疫球蛋白（pi7. 1，分子量146kDa)的 持續(xù)釋放制劑，在大約3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)包括-ac- (RADA) 4-〇)順2和ac- (KLDL) 3-C0NH2自組裝 肽水凝膠。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用圓振二向色性（CD)、熒光光譜分析和免疫測(cè)定法 對(duì)釋放的抗體進(jìn)行分析，據(jù)此可知，整合肽和從肽水凝膠中釋放抗體的過(guò)程基本上不影響 其構(gòu)象和功能?？梢允褂脝畏肿訜晒庀嚓P(guān)光譜（FCS)和石英晶體微量天平（QCM)生物傳感 器技術(shù)監(jiān)控IgG的生物活性。
[0011] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種持續(xù)藥物傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以有效的將治療劑導(dǎo)向具體 的組織，其中這種定向傳遞對(duì)病人產(chǎn)生更小的毒性和副作用。所述可注射的自組裝肽腳手 架系統(tǒng)，其中，在生理?xiàng)l件下，所述凝膠可以被用于包括免疫治療的持續(xù)釋放應(yīng)用，從而在 延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)將活性抗體局部釋放到具體的組織中。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，在大約3 個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，人類(lèi)抗體通過(guò)ac-(RADA)4-C0NH2或者ac-(KLDL) 3-C0NHjic水凝膠緩慢釋放。 所述釋放動(dòng)力學(xué)隨著形成水凝膠的自組裝肽氨基酸序列的變化和水凝膠中肽納米纖維的 密度變化而改變。而且，所述控制釋放系統(tǒng)可以呈遞生物活性蛋白質(zhì)，其中，所述水凝膠釋 放的抗體的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)以及他們的生物活性基本上不受密封和通過(guò)水凝膠釋放 的影響。肽序列的可編程性是獨(dú)特的，并且提供了一種將納米纖維性質(zhì)控制在分子水平的 方法，這反過(guò)來(lái)可以改變生物分子的擴(kuò)散和釋放動(dòng)力學(xué)。
[0012] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0013] 本發(fā)明的前述及其他目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)從下列對(duì)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案的更為具 體的描述中變得顯而易見(jiàn)，如隨后附圖中說(shuō)明的那樣，其中，不同視圖中相同的附圖標(biāo)記指 的是相同的部分。所述附圖不需要按比例繪制，相反，在圖示上突出重點(diǎn)說(shuō)明本發(fā)明的原 則。
[0014] 圖1是（A)ac-(RADA)4-C0NH2肽單體、和其肽納米纖維的圖示、（B)IgG分子的圖示、 (c)肽納米纖維的電子鏡檢術(shù)圖像圖示和⑶腳手架水凝膠的宏觀圖像圖示。IgG和肽的 色彩設(shè)計(jì)：帶陽(yáng)電荷的（藍(lán)色）、帶負(fù)電荷的（紅色）和疏水性的（灰色）。
[0015] 圖2. (A)多層水凝膠的示意圖。（B)多層水凝膠的光學(xué)顯微鏡檢查和（C-D)多 層水凝膠的熒光顯微鏡檢查。為了便于觀察，殼（自組裝ac-(KLDL)3-C0NHj^)裝載有 Alexa-488熒光基團(tuán)（C)并且核（自組裝ac-(RADA)4-C0NHjic)裝載有CY3(D)。
[0016] 圖3. (A)IgG通過(guò)不同肽和不同肽納米纖維密度水凝膠在整個(gè)3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)的 釋放曲線（A)和在頭12天的釋放曲線（B)。由自組裝肽⑴ac-(RADA)4-C0NH2，濃度分別為 〇? 5%重量/體積的（淡藍(lán)色，▲ )、1. 0%重量/體積（藍(lán)色，▲)、和1. 5%重量/體積（深 藍(lán)色，▲)和（ii)ac-(KLDL)3-C0NH2，濃度分別為0.3%重量/體積（紅色，)和0.6%重 量/體積（品紅色，)。在室溫條件下，pH值為7. 4,磷酸緩沖液中進(jìn)行釋放試驗(yàn)。數(shù)據(jù) 點(diǎn)表示五個(gè)樣品的平均計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12%。（C)將IgG釋放曲線繪制成時(shí)間平方根的 函數(shù)，顯示雙相的擴(kuò)散機(jī)理。繪圖最初的線性部分代表IgG通過(guò)所述肽水凝膠的單向擴(kuò)散， 可以根據(jù)菲克定律（等式1)計(jì)算擴(kuò)散系數(shù)。
[0017] 圖4.IgG通過(guò)水凝膠和多層雙組分水凝膠在整個(gè)3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)的釋放 曲線（A)和在頭12天的釋放曲線（B)，所述水凝膠由濃度為1.0 %重量/體積的 ac- (RADA) 4-C0NH2 (藍(lán)色，▲)和濃度為 0? 6 % 重量 / 體積的ac- (KLDL) 3-C0NH2 (品紅色，) 所組成，所述多層雙組分水凝膠由濃度為1. 0%重量/體積的ac-(RADA)4-C0NH2 (核心）和 濃度為〇. 6%重量/體積的ac-(KLDL)3-C0NH2(殼）所組成。在室溫條件下，pH值為7. 4， 磷酸緩沖液中進(jìn)行釋放試驗(yàn)。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示五個(gè)樣品的平均計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12%。（C) 將IgG釋放曲線繪制成時(shí)間平方根的函數(shù)，顯示雙相的擴(kuò)散機(jī)理。繪圖最初的線性部分代 表IgG通過(guò)所述肽水凝膠的單向擴(kuò)散，可以根據(jù)菲克定律（等式1)計(jì)算擴(kuò)散系數(shù)。
[0018] 圖5.人IgG在pH值為7. 4的磷酸緩沖液中的光譜分析（A)天然IgG(實(shí)線）和 肽水凝膠釋放的IgG(虛線）的遠(yuǎn)紫外線圓二色性譜。（B)天然IgG(實(shí)線）和通過(guò)肽水凝 膠釋放的IgG(虛線）的標(biāo)準(zhǔn)化的熒光發(fā)射光譜；激發(fā)波長(zhǎng)是300納米。釋放樣品后2個(gè)月 的時(shí)間內(nèi)在室溫下記錄光譜。
[0019] 圖6.游離的IgG分子在不存在和存在PC-BSA抗原情況下，在通過(guò) ac- (RADA) 4-C0NH2肽水凝膠釋放之前和之后的平移擴(kuò)散時(shí)間。單分子熒光相關(guān)光譜（FCS) 數(shù)據(jù)顯示IgG與抗原的相互作用產(chǎn)生三種不同的種類(lèi)：游離的IgG分子，其擴(kuò)散時(shí)間與單獨(dú) 的IgG擴(kuò)散時(shí)間相似，和與一個(gè)或者兩個(gè)抗原分子鍵合的IgG。在IgG釋放前后這些種類(lèi)的 相對(duì)濃度是相似的。標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%和12%之間。
[0020] 圖7.天然多克隆人IgG(A)和⑶水凝膠釋放的多克隆人IgG與固定的 PC-BSA(抗原）相連（結(jié)合）和解離的QCM隨時(shí)間而變的頻率變化，-dF。零時(shí)代表在流體 管道中注入IgG的時(shí)間，隨后是結(jié)合相。隨著IgG的注射和IgG與固定抗原的結(jié)合，生物傳 感器信號(hào)（黑線）增加，隨著緩沖液的注射（箭頭）導(dǎo)致結(jié)合的IgG解離，生物傳感器信號(hào) 降低。天然IgG和水凝膠釋放的IgG之間計(jì)算的速率常數(shù)的相似性和親合常數(shù)的相似性說(shuō) 明IgG的功能特點(diǎn)在整合和通過(guò)肽水凝膠釋放的過(guò)程中不受影響。紅線代表數(shù)據(jù)擬合。
[0021] 圖8.使用史托-愛(ài)因斯坦方程確定人免疫球蛋白（IgG，分子量146kDa，流體動(dòng) 力學(xué)半徑4= 5.3納米，等電位點(diǎn)pi7. 1)在溶液中的擴(kuò)散常數(shù)，并隨著通過(guò)肽水凝膠釋 放過(guò)程使用菲克定律確定擴(kuò)散常數(shù)。使用誤差傳遞計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（n= 8)。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明涉及一種用于持續(xù)傳遞抗體或者抗體片段的藥物制劑，所述抗體或者抗體 片段包括一種或者一種以上膠體形成肽，其中，所述制劑在至少2周、三周、四周、五周、六 周、七周、八周、九周、十周、十一周、十二周或者更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)顯示持續(xù)的傳遞。在一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明涉及一種制劑，所述制劑包括在電解質(zhì)溶液（例如，生物流體和鹽）存在的 情況下經(jīng)歷溶膠-凝膠變化的自組裝肽。所述制劑可以持續(xù)釋放抗體和抗體片段，尤其是 IgG。隨著水凝膠納米纖維密度的增加，抗體的擴(kuò)散率會(huì)減少，從而提供了一種控制釋放動(dòng) 力學(xué)的方式。
[0023] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及多層水凝膠結(jié)構(gòu)，這些多層水凝膠結(jié)構(gòu)包括基本上同心球狀的 補(bǔ)體和結(jié)構(gòu)上相容肽，例如ac- (RADA) 4-C0NH2核心和ac- (KLDL) 3-C0NH2殼。所述抗體可 以通過(guò)洋蔥樣的體系結(jié)構(gòu)擴(kuò)散，當(dāng)使用補(bǔ)體肽時(shí)可以形成所述洋蔥樣的體系結(jié)構(gòu)。本發(fā)明 的持續(xù)釋放制劑可以在至少兩周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至 少八周、至少九周、至少十周、至少十一周和至少十二周或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)釋放功能上完整的 抗體。在一種優(yōu)選的實(shí)施