具有促神經(jīng)干細(xì)胞增殖活性的訶子乙醇提取物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提取物在藥物、保健品和食品添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是涉及該 提取物的促神經(jīng)干細(xì)胞增殖活性的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 少數(shù)民族藥物是我國(guó)傳統(tǒng)藥物的重要組成部分，其資源豐富，特色鮮明，理論獨(dú) 到，凝結(jié)了數(shù)千年來(lái)少數(shù)民族勞動(dòng)人民與大自然搏斗、與疾病抗?fàn)幍臒o(wú)數(shù)寶貴經(jīng)驗(yàn)。訶子作 為一種傳統(tǒng)民族藥物，在中醫(yī)及中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有著悠久的應(yīng)用歷史，訶子是藏 醫(yī)、蒙醫(yī)常用藥物，被稱(chēng)為"藏藥之王"，"益于百病，升體溫，助消化，用于隆、赤巴、培根、血 病及四種病的合并癥"。據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，訶子有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。其水提、醇提、 丙酮提、乙酸乙酯提、丁醇提等部位提取物均具有抗氧化清除自由基的能力?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究 證明訶子含有神經(jīng)保護(hù)的活性成分，可以對(duì)抗谷氨酸氧自由基等損傷因素對(duì)原代神經(jīng)元的 損傷。但是，目前對(duì)訶子的研究報(bào)道多限于其活性成分提取工藝方面，藥理學(xué)研究明顯不 足，仍需深入研究。
[0003] 神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新、分化的能力。在腦缺血、退行性疾病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病 中，神經(jīng)組織受損傷時(shí)不僅使原有神經(jīng)細(xì)胞減少、活力降低而需要神經(jīng)干細(xì)胞的替代修復(fù)， 同時(shí)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞活性也受到影響。因此，調(diào)控內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化 與神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療關(guān)系密切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種訶子提取物，其具有促神經(jīng)干細(xì)胞增殖的活性，具有 廣泛的應(yīng)用前景，尤其是在腦卒中的治療中可能具有潛在的臨床價(jià)值。
[0005] 本提取物來(lái)自于傳統(tǒng)藥物訶子的果實(shí)。本實(shí)驗(yàn)室先后經(jīng)過(guò)蒸餾水、無(wú)水乙醇、乙酸 乙酯、正丁醇提取分離得到該提取物。首先以4倍訶子藥材量的蒸餾水浸泡過(guò)夜，加熱回流 提取3次，分別為2h、1. 5h、1. 5h，后兩次分別用蒸餾水2倍藥材量，收集提取液。合并三次 提取液，8000rpm離心，棄去沉淀，得訶子總提液（H00)。然后加無(wú)水乙醇3倍量，充分?jǐn)嚢瑁?減壓抽濾，濾液部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味，得醇溶性部位（H01)。最后以正丁醇萃取水層，水層 與正丁醇體積比為1 : 1，萃取6次。剩余水層SOOOrpm離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用蒸 餾水混懸，冷凍干燥，制備5 %~95 %的組分，梯度為10 %，并進(jìn)行促神經(jīng)干細(xì)胞保護(hù)和增 殖活性篩選。
[0006] 建立起大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，制備氧糖剝奪/復(fù)供模型，研究樣品對(duì) 損傷后的體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞促增殖作用。不同劑量訶子提取物對(duì)抗缺氧后神經(jīng)干細(xì) 胞損傷及促增殖的研究結(jié)果如附圖2、3所示，研究結(jié)果表明訶子提取物有明顯的神經(jīng)干細(xì) 胞促進(jìn)增殖和抵抗缺糖缺氧損傷的作用。然后，采用光化學(xué)法建立SD大鼠腦梗死模型，我 們研究了提取物對(duì)各組大鼠的腦組織病理改變，同時(shí)應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白Nestin免 疫組化對(duì)提取物影響神經(jīng)干細(xì)胞在體增殖及機(jī)制進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖4、5所示，結(jié) 果顯示提取物具有改善腦梗死腦組織病變的效果，表明其神經(jīng)保護(hù)作用；此外，Nestin在 腦組織中的變化也表明訶子提取物還具有誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、再生的能力。
【附圖說(shuō)明】
[0007] 圖1為神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定圖，顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)NSCs. A :NSCs常規(guī)培養(yǎng) 第7天（200 X) B :第3代傳代NSCs克隆球（200 X) C :NSCs克隆球Nestin染色，F(xiàn)ITC標(biāo)記 (400X) 〇 圖2為訶子5%-95%乙醇提取物對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞活力的影響(i ±SD, n=6)。 圖3為75 %訶子乙醇提取物促進(jìn)體外培養(yǎng)缺血再灌注損傷后神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)改 變.a.正常組b.模型組c.陽(yáng)性藥組d.高劑量組e.中劑量組f.低劑量組。 圖4為75%訶子乙醇提取物對(duì)各組神經(jīng)干細(xì)胞活力的影響(元±SD, n=6)。 圖5為75 %訶子乙醇提取物對(duì)各組大鼠大腦皮層病理形態(tài)學(xué)改變的影響.a.假手術(shù)組 b.模型組c.陽(yáng)性藥組d.高劑量組e.中劑量組f.低劑量組。 圖6為75%訶子乙醇提取物對(duì)各組大鼠 NSCs標(biāo)記蛋白Nestin的影響。A圖為各組大 腦皮層Nestin免疫組化結(jié)果（a.假手術(shù)組b.模型組c.陽(yáng)性藥組d.高劑量組e.中劑 量組f.低劑量組）B圖為大鼠皮層Nestin表達(dá)平均吸收光密度值.(5 土SD，n=5)。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 實(shí)施實(shí)例1本發(fā)明5% -95%乙醇提取物對(duì)體外神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力影響的研究 [0009] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0010] 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0011] 一日齡新生Wistar大鼠，2~3g，SPF級(jí)，由北京維通利華有限公司代購(gòu)，許可證 編號(hào)：SCXK (京）2011-0012。
[0012] 1.2儀器和試劑
[0013] 超凈工作臺(tái)（北京醫(yī)療設(shè)備廠，中國(guó)），C02培養(yǎng)箱（CB150, Binder，德國(guó)），三 氣培養(yǎng)箱（HERAcell 150, Thermo,美國(guó)），臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（5804R，Eppendorf，德 國(guó)），倒置熒光顯微鏡（IX-8, Olympus，日本），純凈水機(jī)（MILLI-Q，Millipore，美國(guó)）， 多功能自動(dòng)讀板儀（Flexstation3，Molecular Devices，美國(guó)），DMEM/F12培養(yǎng)基、添加 劑B27 (Gibco公司，美國(guó)），重組牛堿性成纖維生長(zhǎng)因子bFGF(珠海億勝生物制藥有限公 司），青霉素、鏈霉素（華北制藥股份有限公司），山羊血清（北京索萊寶科技有限公司）， Triton X_100(Amresco公司，美國(guó)），Nestin兔抗鼠一抗（Sigma公司，美國(guó)），F(xiàn)ITC標(biāo)記山 羊抗兔二抗（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司），NaCl (天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）， Na2HP04 · 12H20、碳酸氫鈉、Na2S204、95%乙醇、Κ 2ΗΡ04(分析純，北京化工廠），KC1 (國(guó)藥集團(tuán) 化學(xué)試劑有限公司），多聚甲醛（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）CCK-8(同仁化學(xué)研 究所，日本），5%-95%訶子乙醇提取物（實(shí)驗(yàn)室自制）。
[0014] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0015] 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0016] 取一日齡新生wistar大鼠，以75%乙醇浸泡滅菌，置于無(wú)菌工作臺(tái)中冰上操作， 取出大腦置于4°C PBS中，剝離血管和腦膜。取皮層置盛有4°C PBS液的平皿中，洗3次，以 減少紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞等雜細(xì)胞。冰上操作，在青霉素小瓶中將腦皮層組織剪成泥狀，加培 養(yǎng)基2ml，用火焰拋光的膠頭滴管（5ml、lml、0. 2ml)各吹打5次，靜置2min，200目篩過(guò)濾 取上清移入另一個(gè)離心管中配平，1000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C，離心5分鐘。棄上清，加入DMEM/F12 完全培養(yǎng)基，輕輕吹打成細(xì)胞懸液。取20 μ 1細(xì)胞懸液加入到20 μ 1 0. 4%臺(tái)盼籃染液中， 2min后計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，按5X105cellS/mi的濃度接種于25cm 2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。 置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。于第3-4天半換液，5-7天可見(jiàn)典型的干細(xì)胞克隆 球，并進(jìn)行傳代，以2x 105cells/ml接種。
[0017] 2. 2神經(jīng)干細(xì)胞鑒定
[0018] Nestin蛋白為NSCs特異性表面標(biāo)記蛋白，利用免疫熒光技術(shù)，以兔抗鼠 Nestin - 抗和FITC標(biāo)記二抗鑒定NSCs。離心收集體2. 1中克隆球，接種到預(yù)先置入鋪有多聚賴(lài)氨酸 蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，每孔內(nèi)加入lml神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基。將24孔培養(yǎng)板放入的37 °C、 5% 0)2培養(yǎng)箱中，貼壁2h后取出，吸去培養(yǎng)基，每孔加入1 : 100稀釋的兔抗Nestin多抗 20(^1，，4°(：冰箱過(guò)夜，次日吸去一抗，用？85清洗3遍后，加入1:100稀釋的結(jié)合有？11^ 的山羊抗兔二抗，避光、室溫下輕輕振搖2h，用PBS清洗3遍后，甘油磷酸緩沖液封片，熒光 顯微鏡（激發(fā)光波長(zhǎng)為495nm，吸收光波長(zhǎng)為520nm)下觀察Nestin陽(yáng)性免疫熒光標(biāo)記克隆 球的情況。
[0019] 2. 3神經(jīng)干細(xì)胞0GD/R損傷模型的建立
[0020] 收集傳代3次的克隆球，用吹打法分散制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為5X 105接種 于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)第2天，細(xì)胞呈貼壁未發(fā)生分化狀態(tài)時(shí)用于模型制備。三氣培養(yǎng)箱通 入氮?dú)?，降低氧含量?%，培養(yǎng)的NSCs中吸出原培養(yǎng)基，每孔加入100 μ 1無(wú)糖Earle' s 平衡鹽溶液替代，放入三氣培養(yǎng)箱中缺糖缺氧培養(yǎng)6h，吸棄Earle's液換以正常培養(yǎng)基，培 養(yǎng)48h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活力測(cè)定。
[0021] 2. 4實(shí)驗(yàn)分組
[0022] 1)正常對(duì)照組（Contrl):進(jìn)行正常培養(yǎng)，在制備0GD/R模型時(shí)同步換以含2% B27 和 50ng bFGF 的 Earle' s 液。
[0023] 2)缺糖缺氧再灌注損傷組（0GD/R):方法見(jiàn)2. 3。
[0024] 3)給藥組為訶子乙醇提取物5%~95%的各組分，梯度為10%，且各組分濃度均 為3 μ g/mL，其他處理同模型組。
[0025] ，2. 5增殖能力檢測(cè)
[0026] 收集傳代3次的克隆球，用吹打法分散制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為 5xl05cells/ml，將細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μ 1，每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔。建立0GD/R損傷 模型后，細(xì)胞換為正常培養(yǎng)基，給藥組添加相應(yīng)劑量的藥物，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。 然后在每個(gè)孔中加入10 μ 1的CCK-8溶液，將細(xì)胞板放在培養(yǎng)箱中孵育4h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在 450nm處的吸光度。
[0027] 2. 6統(tǒng)計(jì)方法
[0028] 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS18. 0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。正常組與模型組均數(shù)比較用t 檢驗(yàn)，模型組與藥物處理組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間均數(shù)兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。
[0029] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0030] 3. 1原代培養(yǎng)大鼠 NSCs的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定結(jié)果
[0031] 利用倒置相差顯微鏡觀察，常規(guī)培養(yǎng)至第7天，可見(jiàn)典型克隆球，由幾十個(gè)至數(shù)百 個(gè)細(xì)胞組成，呈球形懸浮生長(zhǎng)（圖1A)。傳代3次后的克隆球，邊界清晰，球內(nèi)細(xì)胞形態(tài)規(guī) 貝1J、大小一致，無(wú)突起生長(zhǎng)，直徑約為100 μm(圖1B)。經(jīng)免疫熒光染色后顯示各克隆球內(nèi)細(xì) 胞呈Nestin陽(yáng)性（圖1C)。
[0032] 3. 2細(xì)胞活性結(jié)果
[0033] 利用CCK-8檢測(cè)NSCs的存活率，結(jié)果顯示，NSCs造模給藥后，訶子提取物5 %~ 95%的各組分能夠明顯地提高NSCs的數(shù)量，且明顯高于模型組，提示訶子提取物5%~ 95 %的各組分能夠顯著促進(jìn)NSCs增殖（圖2)。
[0034] 施實(shí)例2本發(fā)明提取物對(duì)體外促神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的研究
[0035] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0036] 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0037] 同實(shí)施例1
[0038] 1. 2儀器和試劑
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