載有化療抗癌藥物的納米顆粒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及腫瘤學(xué)。本發(fā)明涉及利用載有至少一種化療抗癌 藥物的納米顆粒對癌癥的治療，尤其是肝細(xì)胞癌。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥具有細(xì)胞不受控制地生長外加惡性行為：侵入以及轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。在大部分工 業(yè)化國家中，這是死亡的主要原因。可以使用不同的癌癥治療方法：化學(xué)療法、放射療法、外 科手術(shù)、免疫療法以及激素療法。
[0003] 化學(xué)療法可以被定義為化療抗癌劑用于治療癌癥的應(yīng)用。從廣義上講，大部分化 療抗癌劑通過削弱有絲分裂（細(xì)胞分裂）或者DNA合成起作用，有效地靶向快速分裂細(xì)胞。
[0004] 化療抗癌劑最常通過腸道外途徑給藥，值得注意的是靜脈內(nèi)注射（IV)或者動脈 內(nèi)注射（IA)。可以以不同的時長進(jìn)行IV或IA化療，這取決于藥物以及所治療的癌癥類型。
[0005] 肝細(xì)胞癌（HCC)為男性第五（全世界523, 000例）、女性第七（全世界226, 000 例）最常見的癌癥，并且大部分發(fā)生在發(fā)展中國家，近85%的病例發(fā)生在這些國家，尤其在 男性當(dāng)中：整體男性/女性比例為約4/1。高發(fā)地區(qū)為東亞以及東南亞、中西非，以及美拉 尼西亞以及密克羅尼西亞/波利尼西亞。發(fā)達(dá)地區(qū)比例估計較低，南歐除外，其男性發(fā)病率 (ASR 10. 5 人 /100, 000 人）明顯高于其他發(fā)達(dá)地區(qū)（Globocan 2008, WHO, International Agency for Research on Cancer-IARC-, Cancer Incidence and Mortality Worldwide 2008)〇
[0006] 2008年估計有694, 000人死于肝癌（477, 000男性，217, 000女性），由于其高致命 性（死亡率與發(fā)病率的整體比例為〇. 93)，肝癌是全球因癌癥死亡的第三大最常見原因。其 死亡率的地區(qū)分布與發(fā)生率的地區(qū)分布相似（Globocan 2008, WHO, International Agency for Research on Cancer-IARC-, Cancer Incidence and Mortality Worldwide 2008)。
[0007] HCC通常發(fā)生在患有肝硬化或慢性肝?。–LD)的人群中。因此，所有對CLD或肝 硬化發(fā)展有幫助的因素均為HCC的風(fēng)險因素。主要的發(fā)病因素為乙型肝炎病毒感染（HBV; 53% )、丙型肝炎病毒感染（HCV;25% )、酒精性肝病（ALD;15-43% )或者代謝不良性疾 病，如非酒精性脂肪性肝炎（NASH ;20% )肥胖癥以及糖尿病。其他因素出現(xiàn)頻率較低： 血色病、其他慢性膽道或炎癥性肝病。由生長在谷物、花生及其他食品上的真菌黃曲霉 (Aspergillus flavus)和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)產(chǎn)生的黃曲霉毒素為肝毒 素，長期暴露于這些霉菌毒素將引起HCC的發(fā)展。化學(xué)品的影響仍存在爭議并且并不顯著。
[0008] 目前治療HCC的策略可以分為根治療法，如外科手術(shù)（腫瘤切除和肝移植）、經(jīng) 皮介入（酒精注射、射頻熱消融），或者姑息療法，如經(jīng)動脈介入（主要是動脈化療栓塞或 TACE)、全身治療和試驗(yàn)性策略（H. C. Spangenberg, R. Thimine, Η· E. Blum, Biologies:Targe ts&Therapy，2008, 2(3)，453)。在精心選取的患者中，切除和肝移植能夠使60% -70%的患 者存活5年。不幸的是，多數(shù)西方國家的患者在診斷時處于中期或晚期HCC，導(dǎo)致無法適用 這些根治療法（L. Faloppi, M. Scartozzi, E. Maccaroni, Ρ· M. Di Pietro, R. Berardi, M. Del Prete，S. Cascinu，Cancer Treat. Rev.，2011，37 (3)，169) 〇
[0009] 在姑息療法中，動脈化療栓塞方法（TACE)顯示在16-55%的患者中引起了客觀反 應(yīng)，盡管許多隨機(jī)試驗(yàn)并未顯示其對存活有任何益處。不幸的是，眾所周知TACE常常伴隨著 嚴(yán)重的副作用，如肝衰竭或腎功能不全（K. Kamada, T. Nakanishi, M. Kitamoto, H. Aikata, Y. Kawakami, K. Ito, T. Asahara, G. Kajiyama, J. Vase. Interv. Radiol.，2001，12(7)，847) 〇
[0010] 直到最近，沒有可用的療法能夠延長晚期HCC患者的總存活率（OS)，這表明了對 新的革巴向療法的需求（H. C. Spangenberg, R. Thimine, Η· E. Blum, Biologies: Targets&The rapy，2008, 2 (3)，453)。在2007年，索拉菲尼(Nexavar?)，一種多激酶抑制劑，首次在無 法切除的HCC患者中表現(xiàn)出相對于安慰劑的總存活率提高，盡管是不太高的提高。除了 這種試劑，各種不同分子目前正在晚期HCC中試驗(yàn)，其中布立尼布（Brivanib)，另一種口 服多激酶抑制劑，目前正在進(jìn)行一些III期研究（H. C. Spangenberg, R. Thimine, Η· E. Blu m, Biologies:Targets&Therapy, 2008, 2(3), 453-K. Almhanna, PA Philip,Onco. Targets Ther.，2009, 18(2)，261) 〇
[0011] 雖然索拉菲尼是晚期HCC的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)并且被注冊為不受歐洲藥品管理局（EMA)以 及食品和藥品管理局（FDA)限制的HCC治療方法，但是，狹窄的臨床試驗(yàn)入選標(biāo)準(zhǔn)使得許多 患者不具有與他們疾病階段有關(guān)的經(jīng)驗(yàn)證的有效治療。此外，因?yàn)橐恍┗颊叱霈F(xiàn)了索拉菲 尼治療失敗，對那些患者仍然存在改善治療效果、給藥方案、整體耐受性以及克服耐藥性的 醫(yī)療需求（M. Peck-Radosavl jevic, Therap. Adv. Gastroenterol. 2010, 3 (4)，259) 〇
[0012] 已知HCC作為富血管實(shí)體腫瘤具有高度耐藥性的特點(diǎn)（T. Wakamatsu，Y. Nakahashi，D. Hachimine，T. Seki，K. Okazaki, Int. J. Oncol.，2007, 31 (6)，1465)。HCC 的 這種藥物抗性的機(jī)制是多重的。然而，更常見的機(jī)制與多藥耐藥（MDR)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、P-gp以 及 MRP 栗有關(guān)（D.M. Bradshaw, R. J.Arceci, J. Clin. Oncol.，1998, 16(11)，3674. Review. Erratum in: J. Clin. Oncol.，1999, 17(4)，1330)。這些栗允許腫瘤細(xì)胞將不同類型的化療 藥物排出至細(xì)胞外環(huán)境（Y. Chen, S.M. Simon, J. Cell Biol. 2000, 148(5),863)。與 MDR表現(xiàn) 型相關(guān)的藥物抗性可以是自發(fā)的或是在化療期間后天獲得的。不管是自發(fā)的還是后天的， 藥物抗性在癌癥治療中都是嚴(yán)重的問題。HCC常常自發(fā)地耐藥，這是其治療失敗的主要原 因（R.P6rez_Tom0s，Curr Med Chem·，2006, 13 (16) ,1859, Review)。這給癌癥化療帶來了 很大的障礙，因?yàn)樾枰褂酶邉┝康乃幬锊⑥D(zhuǎn)而引起嚴(yán)重的副作用（F. Yan，X. M. Wang，Z. C. Liu, C. Pan, S. B. Yuan, Q. M. Ma，Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 2010, 9 (3)，287)。藥 物抗性對大多數(shù)化療藥物造成影響，尤其是蒽環(huán)類（如阿霉素）、長春花生物堿、表鬼臼毒 素或紫杉烷。MDR基因過表達(dá)引起的化療藥物療效不佳，強(qiáng)化了開發(fā)考慮耐藥問題的新的 HCC治療策略的需求。
[0013] 阿霉素為化療化合物，其療效在包括HCC的多種癌癥中得到體現(xiàn)。然而，HCC中阿 霉素 IV輸注的療效不太好，客觀反應(yīng)率為5-10%。一個大型的、隨機(jī)的、涉及多個研究中 心的臨床試驗(yàn)對比了通過IV途徑施以60mg/m2阿霉素以及諾拉曲特（thymitaq)，一種直接 胸苷酸合成酶抑制劑（Porta C.，2006)的療效。在隨機(jī)選取的446個無法切除的HCC患者 中，發(fā)現(xiàn)阿霉素的效果不太大。認(rèn)為阿霉素在HCC患者中的效果不太大是由與Pgp和MRP 細(xì)胞栗過度活躍相關(guān)的多藥耐藥（MDR)機(jī)制造成。為了克服耐藥問題，評估過許多策略，包 括Pgp和MRP抑制劑的使用。由于其安全性，這些藥物的開發(fā)已停止。
[0014] 在HCC中，為了降低全身毒性，研發(fā)出了通過肝動脈（ΙΑ)內(nèi)注射使用細(xì)胞毒性藥 物的新治療策略，以誘發(fā)重要的肝癌細(xì)胞壞死并保留健康的肝實(shí)質(zhì)。
[0015] 專利ΕΡ1056477及其美國同族專利US6881421所描述的技術(shù)利用聚氰基丙烯酸烷 酯（PACA)聚合物將活性成分配制成納米顆粒。ΕΡ1056477及其美國同族專利US6881421指 出在納米顆粒的制備期間利用絡(luò)合劑復(fù)合活性成分，以保護(hù)活性成分抵抗顆粒形成所必需 的化學(xué)反應(yīng)。因此，所述活性成分有利地以非共價方式與所述顆粒相連并被保護(hù)以避免反 應(yīng)或降解。因此，ΕΡ1056477及其美國同族專利US6881421教導(dǎo)了包含藥物活性成分、如聚 氰基丙烯酸烷基酯的聚合物以及如環(huán)糊精的絡(luò)合劑的納米顆粒。
[0016] 載于所述納米顆粒中的阿霉素（以下稱為"載有阿霉素的納米顆粒"）是一種將一 種PACA，即聚氰基丙烯酸異己酯（PIHCA)、納米顆粒與化療藥物阿霉素相關(guān)聯(lián)的藥物制劑。
[0017] 所述納米顆粒呈現(xiàn)原始機(jī)制以繞過MDR，其可以總結(jié)為：
[0018] 載有阿霉素的納米顆粒吸附于腫瘤細(xì)胞的表面并在細(xì)胞膜附近釋放包埋的阿霉 素，產(chǎn)生局部高梯度濃度（Colin de Verdifere A, Cancer Chemother Pharmacol. 1994; 33(6) :504-8) 〇
[0019] 所述納米顆粒降解并釋放可溶性聚氰基丙稀酸（polycyanoacrylic acid)，其 可與細(xì)胞質(zhì)膜相互作用并有助于改善阿霉素的細(xì)胞內(nèi)傳遞（De Verdifere AC，Br J癌 癥· 1997 ;76 (2):198-205)。
[0020] 可溶性聚合物還可以作為沒有任何共價鍵的離子對，掩蓋阿霉素的正電荷從而防 止其被 Pgp 排出（De Verdifere AC，Br J Cancer. 1997 ;76 (2) :198-205)。從而避免與 MDR 栗（Pgp和MRP)的直接相互作用。
[0021] 在男性中，在2個臨床試驗(yàn)中評估經(jīng)肝動脈內(nèi)途徑的載有阿霉素的納米顆粒的療 效和安全性：一個開放式的Ι-Π 期臨床試驗(yàn)以及一個隨機(jī)的II期臨床試驗(yàn)（表1)。
[0022] 表1 :載有阿霉素的納米顆粒的臨床研發(fā)的研究設(shè)計概要
[0024] 根據(jù)涉及多個中心的、開放的、劑量逐步提高的設(shè)計，在患有HCC的患者中進(jìn)行 BA2002/03/02號研究（在晚期肝細(xì)胞癌患者中的第I/II階段的研究）。通過肝動脈內(nèi)（IA) 途徑推注注射載有阿霉素的納米顆粒。3個患者的連續(xù)性隊(duì)列注射10、20和30mg/m2單劑 量的載有阿霉素的納米顆粒。由于對30mg/m2劑量的耐受性良好，方案被修改為評價40mg/ m2然后35mg/m2。因?yàn)檫@兩種劑量被認(rèn)為是有毒的，對其他患者在15分鐘內(nèi)施以30mg/m 2的 載有阿霉素的納米顆粒劑量。兩例患者接受第二次IA劑量的載有阿霉素的納米顆粒，一例 患者接受3次IA輸注。
[0025] 該研究中包括20例患者。除了在35和40mg/m2時記錄有嚴(yán)重的呼吸方面的 TEAEs (治療中出現(xiàn)的不良事件），耐受性還可以接受，大部分TEAEs持續(xù)時間短并且嚴(yán)重性 較輕。全部都是可逆的并且沒有后遺癥。整體上，由于在使用游離阿霉素時已有記錄，有 50%不嚴(yán)重的TEAEs是預(yù)計到的。最常見的TEAE是白細(xì)胞減少癥（η = 13 ;65% )、嗜中性 白血球減少癥（η = 12 ;60)、惡心（η = 10 ;50% )、貧血和腹痛（η = 9 ;45% )、乏力、發(fā)熱、 脫發(fā)（η = 6 ;30% )以及咳嗽（η = 5 ;25% )。有11例患者報告有轉(zhuǎn)氨酶升高（55% )，預(yù) 計很可能與治療效果有關(guān)。在載有阿霉素的納米顆粒的劑量為35mg/m2時，兩例患者出現(xiàn) 嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS)。
[0026] 療效數(shù)據(jù)清楚地表現(xiàn)出存活平均值和中間值分別為548天和315天的療效信號， 根據(jù)臨床研究標(biāo)準(zhǔn)，客觀反應(yīng)率為65-80%。
[0027] 基于這些數(shù)據(jù)，將肝內(nèi)IA輸注15分鐘載有阿霉素的納米顆粒的療效和安全性與 護(hù)理治療標(biāo)準(zhǔn)的療效和安全性進(jìn)行了對比。
[0028] 根據(jù)涉及多個中心的、相對的、開放的、隨機(jī)（2/1的比例）的設(shè)計，在患有晚期HCC 的患者中進(jìn)行第二組研究BA2006/03/03 (在晚期HCC患者中的II/III期研究）。以30mg/ m2的劑量通過ΙΑ途徑輸注15分鐘載有阿霉素的納米顆粒，之前和之后進(jìn)行術(shù)前口服甲基 強(qiáng)的松。該研究的第一部分包括50例患者。33例患者以四周的間隔接受3次載有阿霉素 的納米顆粒輸注，其他17例患者中的每一個均接受與其疾病嚴(yán)重性相適應(yīng)的最高標(biāo)準(zhǔn)的 護(hù)理治療。在該第I期的最后，如果認(rèn)為載有阿霉素的納米顆粒在2/3的患者中有效（患 者3個月沒有局部進(jìn)展），則另外納入150例患者。
[0029] 該研究在納入28例患者時提前停止，因?yàn)槌霈F(xiàn)了導(dǎo)致2例經(jīng)載有阿霉素的納米顆 粒治療的患者死亡的ARDS。17例患者接受了 39次載有阿霉素的納米顆粒輸注，11例隨機(jī) 分組在對照組。試驗(yàn)對照組中沒有患者因 ARDS死亡。
[0030] 盡管載有阿霉素的納米顆粒組中的許多患者因提前停止實(shí)驗(yàn)而沒有根據(jù)方案完 成治療（輸注3次，間隔4周），載有阿霉素的納米顆粒組中有63%的患者在第3個月沒有 出現(xiàn)局部進(jìn)展（對照組中75%的患者出現(xiàn)局部進(jìn)展）。對所納入的患者進(jìn)行監(jiān)控并且存活 記錄截止至2011年2月。載有阿霉素的納米顆粒組的整體存活時間比試驗(yàn)對照組顯著延 長。在該時間點(diǎn)，載有阿霉素的納米顆粒組的整體存活時間的平均值和中間值為952天，