Nonratt021972小干擾rna在制備糖尿病并發(fā)心臟自主神經(jīng)疾病藥物的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及糖尿病并發(fā)心臟自主神經(jīng)病變藥物用途發(fā)明領域。
【背景技術】
[0002] 糖尿?。―iabetesMellitus，DM)是一組代謝性臨床綜合征，隨著社會的發(fā)展和人 們生活水平的提高糖尿病的患病率逐年升高，在發(fā)達國家糖尿病患病率已達3 % -7 %，成 為僅次于癌癥、艾滋病、心腦血管病之后第4位需要優(yōu)先考慮的疾病，已成為世界第5位死 亡主因。糖尿病分為1型（胰島素依賴性）和2型（非胰島素依賴性）糖尿病。據(jù)估計，全 球六個人里面就有一個人處于患糖尿病并發(fā)癥的危險中。我國糖尿病人群的構成以2型糖 尿病為主，占糖尿病人群的90%以上，嚴重影響著人民健康和社會發(fā)展。糖尿病自主神經(jīng)病 變（Diabeticautonomicneuropathy,DAN)是一組由自主神經(jīng)功能和（或）結構受損引發(fā) 的征候群，主要累及心血管、胃腸道和泌尿生殖系統(tǒng)，具有起病隱匿、逐漸進展、可于癥狀出 現(xiàn)前發(fā)生、甚少自行緩解的臨床特征。其中，糖尿病心臟自主神經(jīng)病變（Diabeticcardiac autonomicneuropathy,DCAN)危害尤為嚴重，可以引起無痛性心肌缺血、心肌梗死及惡性 心律失常甚至心源性猝死。自主神經(jīng)包括交感和副交感神經(jīng)，從中樞下行的交感或副交感 神經(jīng)通過外周自主神經(jīng)節(jié)換神經(jīng)元后支配心臟等內(nèi)臟器官等。心率和血壓的變化直接受到 自主神經(jīng)系統(tǒng)（交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)）活動的影響。
[0003] Pannexin-Ι基因是2000年發(fā)現(xiàn)的縫隙連接蛋白家族新成員，研究表明 Pannexin-Ι蛋白可以在細胞膜上組成半通道或在細胞間形成縫隙連接通道，參與多種重要 的生理病理過程。縫隙連接半通道（hemichannels)是縫隙連接通道的亞單位，在脊椎動物 體內(nèi)每一個半通道都是由Connexin或Pannexin蛋白組成的跨膜六聚體所構成，相鄰細胞 的兩個半通道兩兩對接形成中空管道，介導小分子物質(zhì)的流動，實現(xiàn)了細胞間信息和物質(zhì) 的快速交流與溝通。病理情況下Pannexin-Ι半通道的異常激活，細胞外ATP顯著增加，并 作用于嘌呤受體，從而激活Pannexin-Ι半通道介導的ATP誘導的ATP釋放，并形成惡性循 環(huán)，導致細胞外大量ATP的聚集，引起各種離子的異常流動，從而導致細胞內(nèi)離子的紊亂及 能量的缺失，出現(xiàn)細胞的腫脹及細胞膜的崩潰，從而涉及炎癥、免疫系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的多 種功能紊亂與疾病。
[0004] IRS1是胰島素信號通路中的關鍵蛋白，參與細胞的生長和代謝。IRS的磷酸化對 于胰島素信號途徑的轉(zhuǎn)導很重要，其酪氨酸位點磷酸化可使信號正常傳導，但是IRS異常 絲氨酸的磷酸化，常導致IRS的降解從而干擾了胰島素信號的傳導，可能是引起胰島素抵 抗的重要的分子機制。敲除IRS1的小鼠出現(xiàn)2型糖尿病的一系列表現(xiàn)：周圍組織的胰島素 抵抗，高血糖以及β細胞分泌功能障礙，β細胞數(shù)目減少。有報道文獻IRS異常絲氨酸磷 酸化可介導的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胰島素抵抗，并涉及糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機理。
[0005] 大量研究證實，糖尿病高糖高脂毒性時，體內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基不能被清除，即 可產(chǎn)生氧化應激增強。本研究實驗結果表明糖尿病大鼠空腹血糖和餐后血糖明顯升高， 血清氧化應激指標丙二醛（MDA)增多，谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX)和總一氧化氮合酶 (T-NOS)的活性下降，提示糖尿病大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)存在明顯的氧化應激。氧化應激可 誘導大量促炎因子合成釋放，引發(fā)炎癥反應，從而影響神經(jīng)細胞的功能，改變神經(jīng)細胞的微 環(huán)境，參與或加速糖尿病及其心臟自主神經(jīng)病變的發(fā)生、發(fā)展。炎癥細胞因子如腫瘤壞死因 子-a(TNF-α)通路的激活，與包括神經(jīng)病變在內(nèi)的糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生有關。
[0006] 人類和其他高等真核生物的遺傳物質(zhì)只有極小一部分編碼蛋白質(zhì)，而超過97%的 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是功能多樣的核糖核酸（RNA)分子，它們無編碼蛋白質(zhì)的功能，統(tǒng)稱為非編碼核 糖核酸（noncodingRNA，ncRNA)。非編碼RNA以RNA形式調(diào)芐基因表達。非編碼RNA大致分 為2類："看家RNA"與"調(diào)控RNA"。"看家RNA"一般都屬于組成型表達，是細胞生存以及基 本功能的必需成份。"調(diào)控RNA"可分為轉(zhuǎn)錄調(diào)控子、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子、RNA分布調(diào)控因子、蛋 白功能調(diào)節(jié)因子等。"調(diào)控RNA"包括微小核糖核酸（miRNA)、小干擾核糖核酸（siRNA)、可轉(zhuǎn) 錄的假基因、反義RNA、核調(diào)節(jié)子等。調(diào)節(jié)ncRNA又可以分為小非編碼核糖核酸（如miRNA、 siRNA)、長于200nt到超過100kb的長非編碼核糖核酸（LongnoncodingRNA，LncRNA)。隨 著越來越多非編碼基因及其功能被識別和揭示，人們逐漸認識到IncRNA雖無編碼蛋白質(zhì) 的功能，但和蛋白質(zhì)分子一樣重要，甚至是主要的功能性分子，在細胞正常生命活動中發(fā)揮 重要而廣泛的調(diào)節(jié)作用。研究提示IncRNA表達的變化和影響IncRNA的因素改變均與疾病 有關。我們實驗室前期SOLiD高通量大鼠轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選和分子生物學驗證確定頸部交 感神經(jīng)節(jié)存在長非編碼核糖核酸N0NRATT021972 [http://www.noncode,org]，在糖尿病模 型大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)長非編碼核糖核酸N0NRATT021972表達明顯增加。本研究通過糖尿 病模型大鼠長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸（RNA)抑制其表達，觀察長 非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在糖尿病并發(fā)心臟自主神經(jīng)病變中的作用及其 調(diào)控機制，這對探尋糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病機理及防治的新靶點具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個目的在于提供長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA的第 一個新用途，即長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在制備治療糖尿病并發(fā)心臟 自主神經(jīng)疾病藥物中的應用。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的在于提供長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA的第 二個新用途，即長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在制備治療交感神經(jīng)相關疾 病藥物中的應用。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的在于提供長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA 的第三個新用途，即長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在制備泛連接蛋 白-l(Pannexin-l)半通道介導的相關疾病的藥物中的應用。
[0010] 本發(fā)明的第四個目的在于提供長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA 的第三個新用途，即長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在制備胰島素受體底 物-l(IRSl)功能異常介導的相關疾病的藥物中的應用。
[0011] 本發(fā)明通過2型糖尿病大鼠模型，觀察長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾 RNA處理后2型糖尿病并發(fā)心臟自主神經(jīng)病變中的作用及其調(diào)控機制，為長非編碼核糖核 酸N0NRATT021972小干擾RNA用于糖尿病并發(fā)并發(fā)心臟自主神經(jīng)病變的預防和治療提供幫 助。
[0012] 本發(fā)明通過建立2型糖尿病大鼠模型，并對前期篩選出的頸上交感神經(jīng)節(jié)高表達 長非編碼核糖核酸N0NRATT021972進行小干擾RNA，采用基因芯片技術分析長非編碼核糖 核酸N0NRATT021972小干擾RNA處理后引起頸上交感神經(jīng)節(jié)細胞功能相關基因的改變，進 一步通過免疫熒光雙標、Real-timePCR和蛋白印跡法對長非編碼核糖核酸N0NRATT021972 小干擾RNA后改變最明顯的基因進行驗證，觀察長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾 后血糖、血清白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子（TNF-α)、去甲腎上腺素（NE)以及氧化 應激指標丙二醛（MDA)、谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-PX)和總一氧化氮合酶（T-N0S)的變 化，結合長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA后大鼠血壓、心率、心電圖指標、心 率變異性和動脈血壓壓力敏感性等心臟自主功能表現(xiàn)出的差異，評價長非編碼核糖核酸 N0NRATT021972小干擾RNA在頸上交感神經(jīng)節(jié)介導糖尿病自主神經(jīng)功能損傷中的作用及可 能的機制。通過本實驗研究以期進一步了解長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA 在糖尿病治療中的作用及其可能作用的新靶點，并為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的實 驗依據(jù)。
[0013] 本發(fā)明研究顯示糖尿病模型大鼠血糖明顯升高，并存在明顯的氧化應激， Pannexin-Ι表達上調(diào)和炎癥因子釋放增多，IRS1異常絲氨酸磷酸化及IRS1的表達下調(diào)，心 臟自主神經(jīng)功能受損；長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA后，降低大鼠血糖以及 氧化應激水平，抑制糖尿病頸上交感神經(jīng)節(jié)Pannexin-Ι表達的上調(diào)和炎癥因子的釋放，降 低糖尿病頸上交感神經(jīng)節(jié)IRS1異常絲氨酸磷酸化，改善IRS1表達下調(diào)并促進頸上交感神 經(jīng)節(jié)細胞生長，對糖尿病受損的心臟自主神經(jīng)功能產(chǎn)生保護作用。
[0014] 長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在防治糖尿病及并發(fā)疾病的作 用機理涉及：抑制與高糖高脂毒性引發(fā)頸上交感神經(jīng)節(jié)/交感PC12細胞長非編碼核 糖核酸N0NRATT021972高表達相關的縫隙連接蛋白Pannexin-Ι半通道、胰島素受體底 物-1(insulinreceptorsubstrate-1,IRS-1)的表達，對糖尿病并發(fā)疾病及其它相關疾病 產(chǎn)生防治作用。
[0015] 為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面以長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干 擾RNA對2型糖尿病模型大鼠交感神經(jīng)、心血功能異常的作用，及對頸上交感神經(jīng)節(jié)上的縫 隙連接蛋白Pannexin-Ι半通道、胰島素受體底物-1表達的影響實驗和相關結果來證明長 非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA的用途。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明實驗各周期各組大鼠血清IL-6的變化圖。其中圖1 (a)為實驗第5 周末，圖1 (b)為實驗第8周末。實驗分組：正常對照組、糖尿病模型組、糖尿病模型+長非 編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA組和糖尿病模型NCsi組；
[0017] 圖2為本發(fā)明實驗第8周末各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的變化圖。 實驗分組：正常對照組、糖尿病模型組、糖尿病模型+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小 干擾RNA組和糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對照組；其中、〈0. 01表示和正常組比 較，##P〈〇. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0018] 圖3為本發(fā)明實驗第8周末各組大鼠血清去甲腎上腺素（NE)的變化圖。實驗分 組：正常對照組、糖尿病模型組、糖尿病模型+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA組和糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性（NCsi)對照組；其中、〈0. 01表示和正常組 比較，##P〈〇. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0019] 圖4為本發(fā)明頸上交感神經(jīng)節(jié)細胞泛連接蛋白一 1 (Pannexin-Ι)和神經(jīng)元標志物 (NeuN)抗體免疫熒光雙標結果圖。糖尿病模型組大鼠Pannexin-Ι表達明顯高于正常對照 組，長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA處理后模型大鼠的Pannexin-Ι表達降 低。實驗分組：正常對照組、糖尿病模型組、糖尿病模型+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972 小干擾RNA組和糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對照組；
[0020] 圖5為本發(fā)明頸上交感神經(jīng)節(jié)細胞胰島素受體底物-1 (IRS-1)IRS1受體和神經(jīng)元 標志物（NeuN)抗體免疫熒光雙標結果圖。糖尿病模型組大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)IRS1受體表 達顯著低于正常對照組，長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA處理后模型大鼠頸