該小鼠隨機(jī)分配至治療組。在異氟烷/02/N20麻醉下，使用液氮冷凍切除系統(tǒng)(CS76，F(xiàn)rigitronics, Shelton, CT)進(jìn)行冷凍切除(Cryo)，所述系統(tǒng)的尖端由連續(xù)的循環(huán)液氮流冷卻。在兩個(gè)凍融處理循環(huán)期間，腫瘤目視是冷凍的，同時(shí)保持周?chē)】到M織的完整。為了監(jiān)控對(duì)持久腫瘤保護(hù)的誘導(dǎo)，在冷凍切除后的40天使用15*103 B16F10細(xì)胞對(duì)小鼠再次攻擊。在右脅腹皮下注射處于100 μ? PBS中的再次攻擊物(re-challenge)。當(dāng)腫瘤體積超過(guò)1000 mm3或當(dāng)腫瘤突破皮膚屏障時(shí)，處死小鼠。
[0060]注射免疫增強(qiáng)劑
具有全硫代磷酸修飾的主鏈的CpG 1668 ( ‘ 5-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3 ’)購(gòu)自Sigma Genosys (Haverhill, UK)。如Spehr V, ffarrass R, Hocherl K, Ilg T.在Appl.B1chem.B1technol.2011 Oct; 165 (3-4): 761-75 中所述合成 c-d1-GMP。將 CpG 和 / 或C-d1-GMP溶于PBS中進(jìn)行腫瘤周注射(暫時(shí)地(p.t.)，將30 μδ分作兩次20 μ?的注射遍布經(jīng)切除的腫瘤)。在切除后的30 min.內(nèi)完成全部注射。
[0061]細(xì)胞因子測(cè)量
使用粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)培養(yǎng)小鼠骨髓樹(shù)突細(xì)胞并在培養(yǎng)第7天收獲。在過(guò)夜溫育期間，將1.2x10s個(gè)細(xì)胞暴露于以下免疫增強(qiáng)劑:CpG 1668 1 μ g/ml,c-GMP 10 μ g/ml, c-d1-GMP 10 μ g/ml。接著，小心收獲上清液并確定IL12或I型IFN生產(chǎn)。對(duì)于IL12，根據(jù)制造商的說(shuō)明(BD B1sciences)使用了 ELISA方法。I型IFN由使用L929 ISRE報(bào)道細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)生物測(cè)定進(jìn)行確定。
[0062]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用時(shí)序檢驗(yàn)(log rank test)分析了 Kaplan Meier存活曲線(xiàn)。采用帶有事后(post-hoc) Bonferroni檢驗(yàn)的AN0VA分析了細(xì)胞因子數(shù)據(jù)。
[0063]結(jié)果:
如在圖1的圖中清楚所示，腫瘤破壞與施用CpG 0DN或c-d1-GMP作為免疫增強(qiáng)劑的組合，相比僅進(jìn)行切除，導(dǎo)致提升的60天后存活率(約50%)(圖1)。然而，腫瘤破壞與施用CpG和c-d1-GMP兩者作為免疫增強(qiáng)劑的組合，導(dǎo)致不尋常的、〉75%的60天后存活率，強(qiáng)于僅施用兩種個(gè)別的免疫增強(qiáng)劑所得到的存活率。
[0064]對(duì)DC與c-d1-GMP和/或CpG溫育后所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的分析揭示這些免疫增強(qiáng)劑的組合導(dǎo)致I型IFN與IL12的協(xié)同生產(chǎn)。
[0065]已知I型IFN是在抗腫瘤環(huán)境中，樹(shù)突細(xì)胞與其它細(xì)胞內(nèi)的有效交叉呈遞所必需的(Diamond, M.S.等人，Journ.0f Experimental Medicine 208: 1989-2003 (2011)) 0
[0066]—般已知白細(xì)胞介素IL12是一種使免疫系統(tǒng)趨向Thl應(yīng)答(該趨向總體上有利于抗腫瘤免疫)的細(xì)胞因子。
[0067]如在圖2中可見(jiàn)的，當(dāng)使用培養(yǎng)基、對(duì)照c-GMP或CpG時(shí)，不產(chǎn)生IFN或僅產(chǎn)生適量的IFN。此實(shí)驗(yàn)中c-d1-GMP的用量(10 μ g/ml)僅導(dǎo)致〈50 U/ml的IFN生產(chǎn)。然而，當(dāng)CpG與c-d1-GMP組合時(shí)，觀(guān)察到強(qiáng)烈的、>200 U/ml的IFN協(xié)同生產(chǎn)。
[0068]圖3證實(shí)當(dāng)使用培養(yǎng)基、對(duì)照c-GMP或僅c-d1-GMP作為免疫增強(qiáng)劑時(shí)，DC不產(chǎn)生IL12。僅CpG自身以濃度依賴(lài)的方式導(dǎo)致適度水平的IL12生產(chǎn)。然而，當(dāng)CpG與c-d1-GMP組合時(shí)，發(fā)現(xiàn)IL12的協(xié)同生產(chǎn)。
[0069]圖例
圖1:與C-d1-GMP和CpG組合的切除后的抗腫瘤記憶應(yīng)答。僅采用冷凍切除，或與標(biāo)示的免疫增強(qiáng)劑組合，處理在右股處皮下生長(zhǎng)的確立的B16F10腫瘤。在切除后于腫瘤周區(qū)域注射含在40 μ? PBS中的免疫增強(qiáng)劑(30 Pg)。四十天之后，在首次用于試驗(yàn)的和沒(méi)有腫瘤的小鼠的脅腹皮下用15000個(gè)B16F10細(xì)胞進(jìn)行再攻擊。該再攻擊物的生長(zhǎng)以Kaplan-Meier存活曲線(xiàn)描述，該曲線(xiàn)顯示:經(jīng)過(guò)與CpG或c-d1-GMP組合的切除后，對(duì)腫瘤長(zhǎng)出的增加的保護(hù)，并且當(dāng)CpG與c-d1-GMP組合時(shí)，有著更好的防護(hù)。相比cryo/CpG/c-di_GMP，cryo/c-d1-GMP 的 /<0.05。
[0070]圖2:當(dāng)與c-d1-GMP和CpG組合治療時(shí)，DC中的I型IFN協(xié)同生產(chǎn)。使用GM-CSF培養(yǎng)小鼠骨髓樹(shù)突細(xì)胞并在培養(yǎng)第7天收獲。在過(guò)夜溫育期間，將1.2xl05個(gè)細(xì)胞暴露于標(biāo)示的免疫增強(qiáng)劑或免疫增強(qiáng)劑的組合:CpG I μ g/ml, c-GMP 10 μ g/ml, c-d1-GMP 10μ g/ml o接著，收獲上清液并由使用L929 ISRE細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)生物測(cè)定確定I型IFN的生產(chǎn)。結(jié)果以帶平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)的平均數(shù)表示，*=/<0.001 vs.所有其它柱。在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中均得到相似的結(jié)果。
[0071]圖3:當(dāng)與c-d1-GMP和CpG組合治療時(shí)，DC中的IL12協(xié)同生產(chǎn)。使用GM-CSF培養(yǎng)小鼠骨髓樹(shù)突細(xì)胞并在培養(yǎng)第7天收獲。在過(guò)夜溫育期間，將1.2xl05個(gè)細(xì)胞暴露于標(biāo)示的免疫增強(qiáng)劑=CpG I μ g/ml, c-GMP 10 μ g/ml, c-d1-GMP 10 μ g/ml。接著，收獲上清液并由標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法確定IL12的生產(chǎn)。結(jié)果以帶平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)的平均數(shù)表示，*=/<0.001。在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中均得到相似的結(jié)果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.藥物組合物，包含免疫刺激量的至少兩種免疫增強(qiáng)劑以及可藥用載體，其中第一免疫增強(qiáng)劑為非甲基化的胞苷鳥(niǎo)苷寡脫氧核苷酸(CpG ODN)并且第二免疫增強(qiáng)劑為3’，5’ -環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(c-d1-GMP)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其用于誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤特異性抗原的免疫應(yīng)答。3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其用于原位腫瘤破壞療法，所述療法包括腫瘤破壞的步驟和施用所述藥物組合物的步驟。4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其特征在于，所述步驟的順序如下: a.腫瘤破壞，和 b.施用所述藥物組合物。5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其特征在于，所述施用所述藥物組合物的步驟在腫瘤破壞后的24小時(shí)內(nèi)實(shí)施。6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其特征在于，所述施用所述藥物組合物的步驟在腫瘤破壞后的12小時(shí)內(nèi)實(shí)施。7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其特征在于，所述施用所述藥物組合物的步驟在腫瘤破壞后的6小時(shí)內(nèi)實(shí)施。8.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其特征在于，所述步驟的順序如下: a.手術(shù)前后施用所述藥物組合物，和 b.腫瘤破壞。9.根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述藥物組合物的施用方式為靜脈內(nèi)、在贅生性塊的引流區(qū)域皮下、腫瘤周或腫瘤內(nèi)，其優(yōu)選級(jí)依次遞增。10.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其用于在患有癌癥的哺乳動(dòng)物中治療癌癥。11.根據(jù)權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述哺乳動(dòng)物已經(jīng)接受了腫瘤破壞。12.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其用于在患有癌癥的哺乳動(dòng)物中治療癌癥中的手術(shù)前后施用，其中所述哺乳動(dòng)物將要接受或已經(jīng)接受了腫瘤破壞。13.一種治療患有癌癥的哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，所述治療方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物的步驟。14.一種治療患有癌癥的哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，所述治療方法包括如下順序的以下步驟: a.原位腫瘤破壞，和 b.施用根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物。15.一種治療患有癌癥的哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，所述治療方法包括如下順序的以下步驟: a.手術(shù)前后施用根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，和 b.原位腫瘤破壞。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含免疫刺激量的至少兩種免疫增強(qiáng)劑以及可藥用載體，其中第一免疫增強(qiáng)劑為非甲基化的胞苷鳥(niǎo)苷寡脫氧核苷酸(CpG？ODN)并且第二免疫增強(qiáng)劑為3’,5’-環(huán)二鳥(niǎo)苷酸（c-di-GMP）。本發(fā)明還涉及這些藥物組合物在誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤特異性抗原的免疫應(yīng)答中的用途。本發(fā)明還涉及其在原位腫瘤破壞療法中的用途，并且涉及這些藥物組合物，其用于治療患有癌癥的哺乳動(dòng)物。
【IPC分類(lèi)】A61K31/7084, A61K31/7088, A61P35/00, A61P37/04
【公開(kāi)號(hào)】CN105263502
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480033486
【發(fā)明人】C.C.施里爾, M.布羅克登, G.阿德馬
【申請(qǐng)人】英特維特國(guó)際股份有限公司
【公開(kāi)日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2014年6月13日
【公告號(hào)】CA2914728A1, EP3007703A1, US20160136197, WO2014198862A1