含有13種甘油酯的藥物組合物、制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及含有13種甘油酯的藥物組合物、制 劑、制備方法及其在制備抗腫瘤和提高機(jī)體免疫功能藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 薏該仁是禾本科薏該屬植物薏該Coix lacryma-jobi L. var ma-yuen (Roman.) Stapf的成熟干燥種仁，為利水滲濕藥，很久以來(lái)為藥食兩用品種?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)薏苡 仁具有鎮(zhèn)痛抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)儭⒔笛蜏p肥等藥理作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通 過(guò)TLC、HPLC-MS、GC等方法對(duì)薏苡仁的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其含有多種活性成分， 主要包括薏苡仁酯、甘油三酯類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、內(nèi)酰胺類(lèi)、薏苡仁內(nèi)酯、糖類(lèi)、留醇類(lèi)、三萜 類(lèi)等化合物。其中，酯類(lèi)是首先被發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤活性的成分，也是報(bào)道最多最受關(guān) 注的化學(xué)成分。雖然目前在中國(guó)臨床上以薏苡仁油為有效成分的康萊特注射劑已得到 普遍應(yīng)用，但關(guān)于其物質(zhì)基礎(chǔ)和抗癌活性成分的研究鮮有報(bào)道，向智敏等[中國(guó)中藥雜 志，2005, 30(18) :1436-1438]僅采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)薏苡仁油中三酯類(lèi)成分進(jìn)行了定性分 析，初步推定12種甘油三酯成分：三亞油酸甘油酯、二亞油酸油酸甘油酯、棕櫚酸二亞油酸 甘油酯、亞油酸二油酸甘油酯、棕櫚酸亞油酸油酸甘油酯、二棕櫚酸亞油酸甘油酯、三油酸 甘油酯、油酸亞油酸硬脂酸甘油酯、棕櫚酸二油酸甘油酯、棕櫚酸亞油酸硬脂酸甘油酯、二 棕櫚酸油酸甘油酯和二油酸硬脂酸甘油酯，但并未對(duì)各成分的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理活性進(jìn) 行深入研究。而薏苡仁油中不僅含有上述甘油三酯成分外，還含有甘油一酯、甘油二酯和脂 肪酸酯等。由此可見(jiàn)，薏苡仁油脂成分的復(fù)雜性，這必然會(huì)使實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制和 臨床用藥安全面臨很大的挑戰(zhàn)。
[0003] 因此，開(kāi)發(fā)一種安全、有效、可控的治療腫瘤和提高機(jī)體免疫功能的藥物即成為本 發(fā)明關(guān)注的熱點(diǎn)。本發(fā)明對(duì)薏苡仁油中甘油二酯和甘油三酯成分逐一進(jìn)行了分離、結(jié)構(gòu)確 證、藥效活性篩選，選取了 13種具有顯著抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的甘油酯單體，將其按照 不同比例組合，進(jìn)行藥效試驗(yàn)研究，得到了本發(fā)明所述的藥物組合物、制劑及其在抗腫瘤和 增強(qiáng)免疫能力中的應(yīng)用。采用本發(fā)明所述組合物用藥，成分及組成確定，能有效保障生產(chǎn)中 各批次成品質(zhì)量的穩(wěn)定性，避免因直接采用薏苡仁粗油入藥因成分復(fù)雜不清而導(dǎo)致的毒副 反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種含有甘油酯的藥物組合物，具體由如下質(zhì)量百分含量 的13種成分組成：
[0005] 1,3-二油酸甘油二酯 0.41-0.59 1-亞油酸-3-油酸甘油二酯 0.93-1.33 U-二油酸甘油二酯 0.24-0.35 1-油酸-2-亞油酸甘油二酯 0.68-0.97 1.2- 二亞油酸甘油酯 0.33-0.48 三亞油酸甘油酯 2.01-2.89 1-油酸-2,3-二亞油酸甘油酯 23.46-33.72 1-棕櫚酸-2,3-二亞油酸甘油酯 3.33-4.78 1,3-二油酸-2-亞油酸甘油酯 2L6-31.05 1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯 9.99-14.35 1.3- 二棕櫚酸-2-亞油酸甘油酯 0.39-17.80 三油酸甘油酯 12.39-17.80 1-棕櫚酸-2,3-二油酸甘油酯 4.26-6.12
[0006] 優(yōu)選的，上述13種成分的質(zhì)量百分含量為：
[0007] 1.3- 二油酸甘油二酯 0.46-0.56 1-亞油酸-3-油酸甘油二酯 L04-1.28 1.2- 二油酸甘油二酯 0.27-0.34 1 -油酸-2-亞油酸甘油二酯 0.76-0.93 U-二亞油酸甘油酯 0.38-0.46 三亞油酸甘油酯 2.26-2.57 1 -油酸-2,3-二亞油酸甘油酯 26.39-32.25 1-棕櫚酸-2,3-二亞油酸甘油酯 3.74-4.58 1.3- 二油酸-2-亞油酸甘油酯 24.30-29.70 1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯 11.23-13.73 1>二棕櫚酸-2-亞油酸甘油酯 0.44-0.53 三油酸甘油酯 13.93-17.03 1-棕櫚酸-2,3-二油酸甘油酯 ]3.93-17.03
[0008] 更優(yōu)選的，上述13種成分的質(zhì)量百分含量為：
[0009] U-二油酸甘油二酯 0.50-0.52 1-亞油酸-3-油酸甘油二酯 1.14-1.18 1.2- 二油酸甘油二酯 0.30-0.31 1-油酸-2-亞油酸甘油二酯 0.83-0.86 1.2- 二亞油酸甘油酯 0.41-0.43 三亞油酸甘油酯 2.47-2.57 1-油酸-2,3-二亞油酸甘油酯 28.73-29.91 1-棕櫚酸-2,3-二亞油酸甘油酯 4.08-4.24 1.3- 二油酸-2-亞油酸甘油酯 24.46-27.54 1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯 12.23-12.73 1,3-二棕櫚酸-2-亞油酸甘油酯 0.47-0.49 三油酸甘袖酯 15.17-15.79 1 -棕櫚酸-2,3-二油酸甘油酯 5.22-5.43
[0010] 其中，所述13種甘油酯成分可以通過(guò)如本發(fā)明實(shí)施例所述方法分離獲得，也可以 采用本領(lǐng)域常規(guī)合成方法制備或者直接市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。
[0011] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種含有甘油酯的藥物制劑，具體包括本發(fā)明所述藥 物組合物及一種或幾種藥學(xué)上可接受的載體。
[0012] 其中，所述藥學(xué)上可接受的載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、乳 化劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或抗氧化劑，必要時(shí)還可以 加入香味劑、甜味劑、防腐劑或著色劑。
[0013] 所述藥學(xué)上可接受的載體可以選自：甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫 代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、大豆磷脂、維生素 C、維生素 E、EDTA二鈉 、EDTA 鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯 化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、羥苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨酸鉀、醋酸氯己定、木糖醇、麥芽糖、葡萄 糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻 酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二 醇、環(huán)糊精、β -環(huán)糊精、磷脂類(lèi)材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣或硬脂酸鎂。
[0014] 所述藥物制劑可以是口服固體制劑、口服液體制劑或注射劑。
[0015] 優(yōu)選的，
[0016] 所述口服固體制劑選自膠囊劑、片劑、滴丸、顆粒劑、濃縮丸中的一種；所述口服液 體制劑選自水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或是一種在使用前可用水或其 它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品；所述注射劑選自納米混懸劑、脂質(zhì)體、乳劑、凍干粉針劑和 水針劑中的一種。
[0017] 更優(yōu)選的，
[0018] 所述注射劑包括如下成分：本發(fā)明所述藥物組合物50~350g，注射用大豆磷脂 或可供注射用大豆磷脂10~40g，注射用甘油或可供注射用甘油15~50g，注射用水加至 1000 ml0
[0019] 其可通過(guò)如下方法制備：
[0020] 稱(chēng)取處方配制量的注射用大豆磷脂或可供注射用大豆磷脂，加適量的注射用水 后，用高剪切分散乳化機(jī)分散至無(wú)塊狀及顆粒狀固體，加入按配方量稱(chēng)取的注射用甘油或 可供注射用甘油，并加注射用水至規(guī)定量，攪拌均勻備用；
[0021] 另稱(chēng)取含有13種活性成分的藥物組合物，將稱(chēng)取的油酯與水相分別加熱至60~ 70°C后，置高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行高壓乳化，乳化時(shí)均質(zhì)機(jī)低壓為5~12MPa，高壓為25~50MPa， 再循環(huán)均質(zhì)3~6遍，至2μηι以下顆粒應(yīng)不少于95%，5 μ m以上顆粒不得檢出，必要時(shí)用 NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至4. 8~8. 5,優(yōu)選6. 8~L 0,最優(yōu)選為6. 8 ;
[0022] 將制得均勻乳劑氮?dú)饧訅和ㄟ^(guò)小于等于3 μ m的微孔濾芯過(guò)濾器過(guò)濾，充氮灌裝 滅菌，冷卻即得。
[0023] 所述膠囊劑包括如下成分：含有13種活性成分的藥物組合物200~800g，抗氧化 劑和/或乳化劑〇. 20~0. 60g，制成1000粒。
[0024] 其可通過(guò)如下方法制備：
[0025] 膠液配制：按重量比為1:0. 6~1. 2:0. 3~0. 8:0. 0001~0. 01稱(chēng)取適量明膠、純 化水、甘油和防腐劑；依次將甘油、純化水、防腐劑（選自10%羥苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨 酸鉀和醋酸氯己定中的一種）加入化膠罐內(nèi)，加熱至70°C~90°C后，再加入明膠不斷攪拌、 抽真空，直至明膠完全溶解，將膠液過(guò)濾，在56~62 °C下存放，備用；
[0026] 藥液配制：將配方量的藥物組合物、抗氧化劑和/或乳化劑（抗氧化劑為維生素 E，乳化劑為吐溫80)加入配料罐內(nèi)，不斷攪拌，直至混合均勻；
[0027] 壓膠囊：根據(jù)膠囊大小選擇合適的壓丸模具，在15~30°C、相對(duì)濕度小于35%條 件下進(jìn)行壓丸定型后干燥，剔除大小丸，再用95%藥用乙醇洗丸后，繼續(xù)干燥至含水量小于 12%，目檢剔除不合格膠囊，印字，包裝即得。
[0028] 本發(fā)明通過(guò)藥效實(shí)驗(yàn)表明，所述藥物組合物及其制劑對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞株均有不 同程度的抑制作用，可作為治療腫瘤疾病藥物。
[0029] 因此，本發(fā)明的目的還在于提供一種上述藥物組合物、藥物制劑在制備抗腫瘤藥 物中的應(yīng)用。以及上述藥物組合物在制備提高機(jī)體免疫功能藥物中的應(yīng)用，及其與LAK細(xì) 胞（淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞）的組合在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0030] 其中，所述腫瘤是指早期、中期或晚期的肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌或 乳腺癌。
[0031] 以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明本發(fā)明所述組合物及其制劑在抗腫瘤和提高機(jī)體免疫功 能方面的有益效果。
[0032] -、體外MTT法測(cè)定藥物組合物及其制劑對(duì)8種人腫瘤細(xì)胞株的抑制作用
[0033] 1、實(shí)驗(yàn)材料及配制
[0034] (1)細(xì)胞株=PANC-I (人胰腺癌細(xì)胞）、SK0V3 (人卵巢癌細(xì)胞）、MCF_7 (人乳腺癌細(xì) 胞）、Bcap-37 (人乳腺癌細(xì)胞）、SMMC-7721 (人肝癌細(xì)胞）、H印G-2 (人肝癌細(xì)胞）、A549 (人 肺癌細(xì)胞）、H460 (人肺癌細(xì)胞），上述細(xì)胞株由上海醫(yī)藥工業(yè)研究藥理評(píng)價(jià)研究中心保存， 傳代維持。
[0035] (2)01^1完全培養(yǎng)基：添加10%新生牛血清（6四0)81^)、雙抗。
[0036] (3)0. 25%胰蛋白酶溶液（Trypsin):購(gòu)自 Invitrogen 公司，-20°C保存。
[0037] (4)磷酸緩沖液（PBS) :NaC18g，KC10. 2g，Na2HPO4L 15g，KH2PO4O. 2g，溶于 IL 雙蒸 水，121°C高壓消毒20min，4°C保存。
[0038] (5) MTT (AMRESC0)溶液：用 PBS 配成 5mg/ml 溶液。
[0039] (6)溶解液：每100mL去離子雙蒸水含SDSlOg，異丁醇5ml，濃鹽酸0· 1ml。
[0040] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0041] 樣品對(duì)上述細(xì)胞株的抑制作用通過(guò)MTT法測(cè)得。
[0042] 具體步驟如下：
[0043] (1)細(xì)胞培養(yǎng)：①將細(xì)胞從液氮中取出，在37°C水浴中迅速解凍，細(xì)胞在無(wú)菌操作 臺(tái)中移入IOml無(wú)菌離心管中加6ml細(xì)胞培養(yǎng)基，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。棄去上清液， 沉淀中加入5~6ml細(xì)胞培養(yǎng)基，滴管吹打使其懸浮后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C細(xì)胞培 養(yǎng)箱內(nèi)。②次日，自培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，棄去細(xì)胞瓶中細(xì)胞培養(yǎng)基，加入5~6ml細(xì)胞培養(yǎng) 基，置37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。③隔日，自培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，棄去細(xì)胞瓶中細(xì)胞培養(yǎng)基，加入 PBS (pH7. 4) 2~3ml晃動(dòng)清洗，倒掉PBS溶液后再重復(fù)一次清洗。在培養(yǎng)瓶中加入3~5滴 0. 25 %胰蛋白酶溶液晃動(dòng)均勻，加蓋置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)3分鐘左右，于顯微鏡下觀察 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自培養(yǎng)瓶壁上脫離，加細(xì)胞培養(yǎng)基2ml，滴管吹打使細(xì)胞完全脫離瓶壁后，分別移 入2個(gè)干凈培養(yǎng)瓶中，加入細(xì)胞培養(yǎng)基5~6ml吹打均勻，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。④隔 日，重復(fù)③步驟。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，貼壁細(xì)胞不允許生長(zhǎng)過(guò)密，懸浮細(xì)胞始終保持對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期。（2)樣品及對(duì)照品制備：稱(chēng)取適量藥物組合物樣品溶解于DMSO中，得到濃度為IOmg/ ml 的溶液。再用 PBS 作梯度稀釋?zhuān)玫綕舛?10mg/ml、5000 μ g/ml、2500 μ g/ml、1250 μ g/ml、 625 μ g/ml、312. 5 μ g/ml 的稀釋樣品。
[0044] (3)將稀釋好的樣品加入平底96孔板中，每孔10 μ 1，每點(diǎn)作兩個(gè)平行測(cè)試。將 DMSO相應(yīng)作梯度稀釋后加入板中，作為對(duì)照。
[0045] (4)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10%小牛血清