一種消除皮膚妊娠紋的干細(xì)胞提取物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及干細(xì)胞提取物的制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 妊娠紋（stretch marks)是婦女妊娠期出現(xiàn)在腹壁、大腿內(nèi)外側(cè)、臀部、后腰、胸部 等部位皮膚的一些寬窄不同、長(zhǎng)短不一的粉紅色或紫紅色的波浪狀花紋；分娩后，這些花紋 的顏色會(huì)逐漸消失，留下白色或銀白色的有光澤的瘢痕線紋。妊娠紋的形成主要是由于妊 娠期激素的影響，加之腹部膨隆使皮膚的彈力纖維與膠原纖維損傷或斷裂，皮膚變薄變細(xì)。 妊娠紋在初產(chǎn)婦尤為明顯，一旦出現(xiàn)多不會(huì)自然消失，并常伴隨皮膚松弛，影響婦女產(chǎn)后的 體態(tài)和身心健康。
[0003] 目前，妊娠紋缺少有效的去除方法。市場(chǎng)上有采用激光、精油和內(nèi)服藥物的方法， 多因效果不夠顯著或伴有明顯副作用等原因，不為多數(shù)人接受。
[0004] 胎盤(pán)是胎兒發(fā)育時(shí)期為胎兒的器官發(fā)育和成長(zhǎng)提供多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的場(chǎng)所，也是胎 兒最初的造血器官。胎盤(pán)具有活躍的合成生物活性物質(zhì)的能力，支持胎兒的發(fā)育，包括多種 激素（蛋白激素和留體激素）和酶。近年研究顯示，胎盤(pán)組織含有多種干細(xì)胞；另外，臍帶 的膠質(zhì)中也蘊(yùn)藏干細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種安全有效的消除妊娠紋的制劑及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的制劑含有胎盤(pán)或臍帶干細(xì)胞分泌的物質(zhì)，稱(chēng)為干細(xì)胞提取物。發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)，該提取物本身，或與其它物質(zhì)形成的組合物，能夠顯著減輕或消除妊娠紋。本提取物為 正常（人）細(xì)胞所產(chǎn)生，對(duì)皮膚無(wú)刺激性。
[0007] 本發(fā)明提供一種制備干細(xì)胞提取物的方法。本發(fā)明所用制備干細(xì)胞提取物的干細(xì) 胞，分離自正常人的胎盤(pán)或臍帶組織，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增。該干細(xì)胞具有共同的特點(diǎn)：能夠 貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞表面表達(dá)⑶140a、⑶105、⑶73和⑶29,不表達(dá)⑶45。
[0008] 本發(fā)明所用制備干細(xì)胞提取物的干細(xì)胞通過(guò)結(jié)合細(xì)胞貼壁特性和表面分子特征 分離獲得；或直接根據(jù)細(xì)胞表面分子特征分選獲得。
[0009] 結(jié)合細(xì)胞貼壁特性和表面分子特征的干細(xì)胞分離方法是，第一步根據(jù)細(xì)胞貼壁特 性分離胎盤(pán)或臍帶細(xì)胞。胎盤(pán)細(xì)胞貼壁分離，方法是將胎盤(pán)組織切成小塊，用冷磷酸緩沖液 (PBS)洗去游離的細(xì)胞，然后用0. 25%胰蛋白酶/HBSS在37°C水浴中進(jìn)行順序消化兩次，每 次10分鐘，收集兩次的消化液，并用等量含10%人血清的DMEM中和、洗滌并接種在細(xì)胞培 養(yǎng)皿中，24小時(shí)后換液去除懸浮細(xì)胞。以后每3天換液一次，7-10天可見(jiàn)干細(xì)胞集落，繼續(xù) 培養(yǎng)至培養(yǎng)皿中細(xì)胞70 %飽和時(shí)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。
[0010] 臍帶細(xì)胞貼壁法分離：將正常人臍帶用PBS反復(fù)沖洗，剝除血管和外膜，收集膠質(zhì) (WhartoV s jelly)，剪切成約Imm小塊，種植在細(xì)胞培養(yǎng)皿上，用含10%人血清的DMEM 在37°C和5% CO2孵箱中培養(yǎng)，3-5天后小心換液，5-7天細(xì)胞從組織周邊長(zhǎng)出，用胰蛋白酶 消化后收集細(xì)胞。
[0011] 上述培養(yǎng)液中的DMEM可用頂DM或a -MEM替代。
[0012] 第二步是根據(jù)細(xì)胞表面分子特征，分離胎盤(pán)和臍帶干細(xì)胞：從上述方法獲得的胎 盤(pán)或臍帶細(xì)胞中，分離CDHOa陽(yáng)性細(xì)胞。方法是先將培養(yǎng)的胎盤(pán)或臍帶細(xì)胞用胰蛋白酶消 化，形成單細(xì)胞懸液，用攜帶抗CD140a抗體的免疫磁珠（Miltenyibiotee)或流式細(xì)胞儀分 選⑶140a陽(yáng)性細(xì)胞。
[0013] 胎盤(pán)干細(xì)胞還可根據(jù)胎盤(pán)干細(xì)胞表面分子特征直接分離，方法是將上述胎盤(pán)組織 消化獲得的單細(xì)胞懸液，先用抗CD45的免疫磁珠去除CD45陽(yáng)性的細(xì)胞，再用攜帶抗CDHOa 抗體的免疫磁珠分離CDHOa陽(yáng)性細(xì)胞；或用流式細(xì)胞儀直接分選CD45陰性/CDHOa陽(yáng)性 的細(xì)胞群。分選出的細(xì)胞用上述無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。
[0014] 胎盤(pán)或臍帶干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)擴(kuò)增：分選出的胎盤(pán)或臍帶干細(xì)胞用無(wú)血 清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，無(wú)血清培養(yǎng)基可選用商品化培養(yǎng)基如MesenGro (StemRD)、 Ultra⑶LTURE (Lonza)等，或自配的含有血清替代成分和細(xì)胞因子（如bFGF)的無(wú)血清培養(yǎng) 基。
[0015] 本發(fā)明所用制備干細(xì)胞提取物的胎盤(pán)和干細(xì)胞還可用懸浮培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。 通過(guò)上述方法分離獲得的胎盤(pán)或臍帶干細(xì)胞，以IO 4Ail的濃度接種到含有明膠包被微載體 (Cultispher)的培養(yǎng)基，在37°C和5% C02條件下用攪拌培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，胎盤(pán)或臍帶干細(xì)胞的表面表達(dá)⑶140a、⑶105、⑶73和⑶29， 不表達(dá)⑶45。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，胎盤(pán)或臍帶干細(xì)胞在經(jīng)過(guò)適當(dāng)誘導(dǎo)后，可分化成皮膚角質(zhì)上 皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。
[0018] 本發(fā)明提供一種干細(xì)胞提取物的制備方法，方法是用人皮膚角質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液 誘導(dǎo)人胎盤(pán)或臍帶干細(xì)胞產(chǎn)生有利于皮膚再生修復(fù)的物質(zhì)。在人胎盤(pán)或臍帶干細(xì)胞培養(yǎng)基 中加入一定量的人皮膚角質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液，誘導(dǎo)培養(yǎng)1-10天，然后與含有0-20%血清的 培養(yǎng)液或磷酸緩沖液在低氧（O 2 < 5% )條件下培養(yǎng)0. 1-120小時(shí)，收集培養(yǎng)液，4°C離心去 除細(xì)胞碎片，低溫儲(chǔ)藏備用。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，干細(xì)胞提取物含有數(shù)十種分泌型蛋白，包括IGF-I、bFGF、EGF、 roGF、EP0等促進(jìn)皮膚再生修復(fù)的生長(zhǎng)因子。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種包含多種生物活性因子的胎 盤(pán)（或臍帶）干細(xì)胞分泌物（干細(xì)胞提取物）本身或與其它物質(zhì)形成的組合物能夠有效減 輕或消除妊娠紋。由于這些生物活性分子由正常細(xì)胞所產(chǎn)生，其濃度及相互間的比例更符 合皮膚的生理所需，有助于皮膚再生修復(fù)。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，本發(fā)明所用消除妊娠紋的干細(xì)胞提取物還可以具有下列附加 技術(shù)特征：
[0021 ] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，干細(xì)胞提取物中添加膠原蛋白、膠原蛋白水解物、透明質(zhì)酸 和白蛋白，或其中的一種，以利于干細(xì)胞提取物中活性成分的穩(wěn)定，或發(fā)揮協(xié)同作用。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1顯示本發(fā)明所用胎盤(pán)和臍帶干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)顯微鏡下圖；
[0023] 圖2顯示本發(fā)明實(shí)施例所用胎盤(pán)干細(xì)胞表面特征性分子的表達(dá)；
[0024] 圖3顯示本發(fā)明實(shí)施例所用胎盤(pán)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后分化形成脂肪細(xì)胞；
[0025] 圖4顯示本發(fā)明實(shí)施例所用胎盤(pán)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后分化形成皮膚上皮細(xì)胞；
[0026] 圖5顯示本發(fā)明干細(xì)胞提取物含有的分泌型蛋白；
[0027] 圖6顯示本發(fā)明實(shí)施例用干細(xì)胞提取物減輕妊娠紋的效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 胎盤(pán)干細(xì)胞的分離與擴(kuò)增培養(yǎng)，具體如下：
[0030] (1)選用正常的人胎盤(pán)，將胎盤(pán)組織切成小塊，用冷磷酸緩沖液（PBS)充分洗去游 離的細(xì)胞，然后用0.25%胰蛋白酶/HBSS在37°C水浴震動(dòng)消化兩次，每次10分鐘，收集兩 次的消化液，并用等量含10%人血清DMEM中和。離心后用10%人血清DMEM懸浮細(xì)胞，并 種植在細(xì)胞培養(yǎng)皿上，24小時(shí)后換液去除懸浮細(xì)胞，以后每3天換液一次，7-10天可見(jiàn)干細(xì) 胞集落，繼續(xù)培養(yǎng)至培養(yǎng)皿細(xì)胞70%飽和時(shí)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。
[0031] (2)用免疫磁珠法分選CDHOa陽(yáng)性細(xì)胞，基本步驟如下（具體可參照 Miltenyibiotec提供的方法進(jìn)行）。首先將以上收集的細(xì)胞用40um微孔的細(xì)胞 篩（BD Bioscience)過(guò)濾細(xì)胞并離心，將細(xì)胞重懸在含1 %人血清的PBS中，加入 Biotin-anti-human Q)140a抗體（Biolegend)，在冰上孵育30分鐘后，用PBS充分洗（加 入20倍體積的PBS，300g離心10分鐘，去掉上清液）。用80 μ 1含1 %血清的PBS重