痤瘡的治療和預(yù)防的制作方法
【專利說明】痤瘡的治療和預(yù)防
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 痤瘡
[0003] 普通痤瘡（Acne Vulgaris)是常見的影響所有年齡，種族和性別的皮膚病況。流 行高峰在青少年中是百分之80-90，但超過十幾歲仍持續(xù)出現(xiàn)，特別是在女性中。痤瘡由于 毛囊的堵塞而發(fā)展。被稱為微粉刺的角質(zhì)化過度和角蛋白和皮脂的堵塞的形成是最早的改 變。微粉刺可以擴大以形成開放粉刺（黑頭）或封閉粉刺（白頭）。在這些條件下，大量 的共生菌痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes)可能會引起導(dǎo)致炎性病變（丘疹和膿 皰）的炎癥。增加皮脂產(chǎn)生的激素活性，如青春期和月經(jīng)期可能會促使痤瘡的形成。
[0004] 目前用于痤瘡的治療包括局部過氧化苯甲酰，局部和口服類視黃酸，局部和口服 抗生素以及用于女性的口服激素。但是，很多各種各樣的不良事件與這些治療有關(guān)：從使用 局部類視黃酸時的皮膚干燥，紅腫和刺激，到使用抗生素時產(chǎn)生抗生素抗性，到使用口服類 視黃酸時的出生缺陷，以及到使用激素時體重增加和血栓。因此需要目前治療方案的更安 全的備選方案。
[0005] 乳鐵蛋白
[0006] 乳鐵蛋白是天然存在于牛奶中的蛋白質(zhì)。美國食品和藥物管理局和歐洲食品安全 局將乳鐵蛋白分類為GRAS (-般認為安全的），用作功能性食品的成分。乳鐵蛋白表現(xiàn)出抗 微生物性，抗氧化性和抗炎癥性。
[0007] 從脫脂奶或從奶酪乳清商購得到牛乳鐵蛋白。理解從脫脂奶和奶酪乳清分離的乳 鐵蛋白之間的區(qū)別對于理解現(xiàn)有技術(shù)是重要的。牛奶蛋白大致分為酪蛋白和乳清。牛奶蛋 白是80%的酪蛋白，酪蛋白是具有4. 6的等電點的相關(guān)磷蛋白（a sl，a S2, β，K)家族的 名稱。酪蛋白相對疏水，使其在水中難溶。酪蛋白以稱為酪蛋白膠束的顆粒懸浮液發(fā)現(xiàn)于 奶中，包裹在可溶性K-酪蛋白分子中。酪蛋白在奶的pH為約6. 6-6. 8時攜帶負電荷。
[0008] 牛奶蛋白是20%的乳清蛋白，其是不依賴pH的可溶的球狀蛋白的集合。乳清蛋白 包括乳球蛋白，α-乳白蛋白和血清白蛋白。這些乳清蛋白具有低于6. 6-一奶的pH 以下的等電點，這意味著它們在奶中作為帶負電的蛋白質(zhì)存在。
[0009] 牛奶中有兩種具有尚于6. 8等電點的微量蛋白。一種是乳鐵蛋白，其是具有報道 7. 8-8. 7的等電點的80kda的蛋白，以及具有9. 6的等電點的乳過氧化物酶。乳鐵蛋白可以 直接從脫脂奶分離。首先，通過離心從全脂奶中去除脂肪以制造脫脂奶。將在6. 6-6. 8的 自然PH的脫脂奶過濾并應(yīng)用于陽離子交換色譜，如羧甲基（CM)-S印hadex，其去除了帶正 電的乳鐵蛋白和乳過氧化物酶。用洗脫乳過氧化物酶的低濃度（1.6% )NaCl溶液將柱洗 滌。隨后用高濃度（5%) NaCl溶液洗脫乳鐵蛋白。將乳鐵蛋白通過超濾濃縮并通過滲濾 從NaCl分離。低熱處理后，凍干乳鐵蛋白以制造粉末。從脫脂奶制備的乳鐵蛋白基本上不 含其他乳清蛋白。下面，我們將會把直接源自脫脂奶的乳鐵蛋白稱為"源自脫脂奶的乳鐵蛋 白"。
[0010] 也可以從作為來自奶酪生產(chǎn)的廢料的奶酪乳清中分離乳鐵蛋白。通過向全脂奶加 入用于酸化的產(chǎn)生乳酸的細菌和粗制凝乳酶（rennet)來制造硬奶酪，如Cheddar奶酪。酸 化和粗制凝乳酶的聯(lián)合作用將奶凝聚為固體（凝乳）和液體（乳清）。凝乳主要是脂肪和 酪蛋白蛋白。乳鐵蛋白最終在乳清中。
[0011] 粗制凝乳酶是從小牛胃得到的酶的復(fù)合物。粗制凝乳酶含有多種酶，包括蛋白酶 凝乳酶和胃蛋白酶，以及脂肪酶。凝乳酶是特異性水解κ酪蛋白的Phel05-106Met中的肽 鍵的天冬氨酸蛋白酶，其去除穩(wěn)定酪蛋白膠束的K-酪蛋白的親水部分，導(dǎo)致酪蛋白凝聚。 K-酪蛋白的親水部分是最終為乳清的稱為糖巨肽（glycomacropeptide)的具有64個氨基 酸的蛋白。已報道糖巨肽是抗細菌的，抗病毒的和抗炎的。
[0012] 在奶酪制造期間使用乳酸菌和粗制凝乳酶的處理也能產(chǎn)生一組蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為朊 間質(zhì)（proteose)蛋白胨，其來源于酪蛋白和乳清蛋白的蛋白水解和水解。朊間質(zhì)蛋白胨是 最終在奶酪制造期間的乳清中的熱穩(wěn)定且酸溶性的蛋白?；旧贤ㄟ^以上對于源自脫脂奶 的乳鐵蛋白描述的相同方法將來自乳清的乳鐵蛋白純化。由于從蛋白水解和水解產(chǎn)生的額 外的堿性蛋白，純化可能更困難并且可能需要額外的步驟。
【背景技術(shù)】
[0013] US 8, 147, 875 B2公開了用于通過口服施用含有乳鐵蛋白和優(yōu)選含有另外的特定 乳清蛋白的乳清蛋白組分來治療痤瘡的方法。根據(jù)這一發(fā)明，"源自奶的酪蛋白的作為糖巨 肽的蛋白質(zhì)和多肽以及朊間質(zhì)蛋白胨也被稱為乳清蛋白"。此外，"優(yōu)選的是，其他乳清蛋白 是堿性的，即其從酸性離子交換樹脂洗脫并具有高于6,特別是高于7的等電點。還優(yōu)選的 是，其他乳清具有IOkD至60kD之間的分子量"。發(fā)明繼續(xù)進一步描述了這些堿性蛋白的優(yōu) 選的N末端序列。因此，這一專利明確地教導(dǎo)了，為了使乳鐵蛋白起作用，其必須存在于含 有在硬奶酪制造期間由乳酸菌和粗制凝乳酶的作用產(chǎn)生的其他乳清蛋白，優(yōu)選堿性乳清蛋 白的乳清蛋白組分中。這一專利沒有教導(dǎo)可以將直接從不含其他乳清蛋白，特別是堿性乳 清蛋白的脫脂奶得到的乳鐵蛋白，并進一步與維生素 E和鋅組合用于治療痤瘡。
[0014] 我們的本發(fā)明顯示，可以將不從乳清獲得的純化乳鐵蛋白，優(yōu)選與維生素 E和鋅 組合用于治療和預(yù)防痤瘡，因此沒有理由相信牛乳鐵蛋白不能被不是從乳清分離的其他乳 鐵蛋白的來源替代。我們的本發(fā)明的優(yōu)選乳鐵蛋白的來源包括直接從脫脂奶分離的牛乳鐵 蛋白和在動物、植物、細菌、真菌和霉菌中產(chǎn)生的重組乳鐵蛋白（牛，人或其他）。在重組乳 鐵蛋白的情況下，因為僅將乳鐵蛋白基因引入宿主，沒有"乳清蛋白"或"乳清蛋白組分"的 概念。
[0015] US 8, 147, 875 B2教導(dǎo)了 "盡管天然牛乳鐵蛋白是用作活性試劑的乳清蛋白組分 的優(yōu)選成分，但可用其他乳鐵蛋白例如來自其他哺乳動物的乳鐵蛋白將其部分或全部代 替……"。這一教導(dǎo)再一次指出了用于使乳鐵蛋白起作用的乳清蛋白組分中的其他乳清蛋 白的重要性。
[0016] US 8, 147, 875 B2進一步公開了 "總之，本研究的結(jié)果形成了堅實的基礎(chǔ)，將包含 乳鐵蛋白攝入物的天然的源自牛奶的生物活性乳清組合物定位為新的策略以預(yù)防和治療 普通痤瘡。與目前的全身和局部療法（基于抗生素、類視黃酸及其他化合物）相比，乳鐵蛋 白/乳清組合物的補充不伴隨副作用并且可以持續(xù)性地使用。"顯然，這教導(dǎo)了乳鐵蛋白必 須與其他乳清蛋白一起存在，以使生物活性乳清組合物起作用。
[0017] US 8, 147,875 B2的實施例1中描述的用于臨床研究的乳清蛋白組分源自 Cheddar乳清并且含有約80 %的乳鐵蛋白，其余是其他乳清蛋白。迄今為止，所有用于痤瘡 治療的口服乳鐵蛋白的公開的臨床研究使用這種含有約20%其他乳清蛋白的粗乳清蛋白 組分。沒有現(xiàn)有技術(shù)臨床數(shù)據(jù)教導(dǎo)口服乳鐵蛋白治療將會起作用，除非其是乳清蛋白組分 的成分，即，除非存在由乳酸菌和粗制凝乳酶蛋白水解和水解產(chǎn)生的其他乳清蛋白。
[0018] 發(fā)明詳述
[0019] 我們已經(jīng)驚奇的地發(fā)現(xiàn)，在沒有由干酪制造期間牛奶蛋白的乳酸菌和粗制凝乳酶 蛋白水解/水解產(chǎn)生的額外乳清蛋白，特別是堿性乳清蛋白的情況下，直接從脫脂奶得到 的乳鐵蛋白可以用于痤瘡的口服治療和預(yù)防。優(yōu)選地，本發(fā)明的乳鐵蛋白與維生素 E和鋅 組合。
[0020] 本發(fā)明顯示，不是從乳清得到的純化的乳鐵蛋白可以用于治療和預(yù)防痤瘡，優(yōu)選 與維生素 E和鋅組合，因此只要不是從乳清分離，就沒有理由相信牛乳鐵蛋白不能被其他