心5 min，用DMEM/F-12完 全培養(yǎng)基洗皮膚干細胞1次，調(diào)整細胞密度以2 ~ 5 X 104個/cm 2密度將皮膚干細胞接種 在飼養(yǎng)層細胞上，用DMEM /F-12完全培養(yǎng)基，37°C、5% C02、90%濕度下傳代擴增，擴增過程 中會分泌很多生長因子，也就是皮膚干細胞活力素； 54、 人皮膚干細胞活力素的獲得 待皮膚干細胞進行傳代擴增到2-10倍后，胰酶37°C消化l_2min、1200-1500 r/min，離 心5 min收集上清液，即獲得人皮膚干細胞活力素。
[0018] 本發(fā)明中，所述飼養(yǎng)層細胞由如下步驟獲得： SI 1、將終濃度為0. 25Pg/ml絲裂霉素 C加至接近匯合的人成纖維細胞(濃度為lxlO5個 /ml)中，37°C過夜，更換DMEM/F-12完全培養(yǎng)基； 512、 0· 25% Trypsin-EDTA消化，懸液lxlO7個/ml中加入絲裂霉素 C，終濃度為2〇μ8/ ml，37°C孵育lh，離心清洗去除絲裂霉素 C，再以lxlO5個/ml的人成纖維細胞進行接種； 513、 再培養(yǎng)1~3 d后，0· 25% Trypsin-EDTA消化，再接種在新的DMEM/F-12完全培養(yǎng) 基中，接種濃度5xl05個/ml或10 4個細胞/cm2; 514、 繼續(xù)培養(yǎng)1~2 d，繼續(xù)培養(yǎng)1~2 d，即可進行皮膚干細胞接種。
[0019] 實施例2 一種人皮膚干細胞活力素的制備方法及其在化妝品凍干粉上的應(yīng)用，所述人皮膚干細 胞活力素凍干粉的保護劑為0. 2 % - 5 %海藻糖。其中的一個配方如下： 甘露醇 3 % 海藻糖 0. 5 % 透明質(zhì)酸 0. 1 % 皮膚干細胞活力素 1 % 無菌水 定容至100ml 皮膚干細胞活力素凍干粉生產(chǎn)工藝： ① 稱取適量的純水到乳化鍋中，之后加入透明質(zhì)酸和甘露醇，85°C均質(zhì)20min ; ② 攪拌均勻后，降溫至60°C左右，加入海藻糖； ③ 4°C低溫條件下，加入皮膚干細胞活力素，攪拌均勻后分裝到西林瓶中，膠塞半加塞， 置于真空冷凍干燥機中進行凍干，凍干后即得本發(fā)明的皮膚干細胞活力素凍干粉。
[0020] 皮膚干細胞活力素溶媒：生理鹽水或PBS等，無菌過濾后即得皮膚干細胞活力素 的溶媒。
[0021] 按個人實際情況，確定施用本品方式及用量。
[0022] 實施例3 一種皮膚干細胞活力素的制備方法及其在化妝品精華液上的應(yīng)用，所述人皮膚干細胞 活力素精華液，加入皮膚干細胞活力素的穩(wěn)定保護劑為海藻糖；保濕增稠劑為聚谷氨酸、輔 酶Q10、透明質(zhì)酸等。其中的一個配方如下： 甘油 5 % 丙二醇 3 % 透明質(zhì)酸 0. 8 % 聚谷氨酸 〇. 5 % 天來可 1 % 海洋彈性蛋白 0.5% 皮膚干細胞活力素 1 % 海藻糖 〇. 2 % 皮膚干細胞活力素精華液嫩膚、去皺試驗： 選取35 - 45歲試驗者60人，男女各半。隨機分為3組，每組20人， 每組分別使用皮膚干細胞活力素精華液、空白對照品和市售嫩膚產(chǎn)品，連續(xù)1個月，然 后分別評價其嫩膚、去皺的美容效果。
[0023] 表1 嫩膚、去皺試驗結(jié)果
由上表可以看出，皮膚干細胞活力素精華液嫩膚、去皺的美容效果好，且優(yōu)于市售的美 容產(chǎn)品及皮膚干細胞活性素。
[0024] 以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范 圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技 術(shù)方案所作的各種變形和改進，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種人皮膚干細胞活力素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 51、 皮膚干細胞的獲?。喝碓从诮】敌律鷥夯蛐旱陌そM織，經(jīng)磁珠篩選法篩選出 皮膚干細胞； 52、 皮膚干細胞的接種培養(yǎng) 將得到的皮膚干細胞接種在飼養(yǎng)層細胞上，傳代擴增培養(yǎng)； 53、 人皮膚干細胞活力素的獲得 待皮膚干細胞進行傳代擴增到2-10倍后，胰酶消化、離心，收集上清液，獲得人皮膚干 細胞活力素。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人皮膚干細胞活力素的制備方法，其特征在于，所述皮膚干 細胞來源于包皮的全厚皮膚，即皮下組織剪除后的包皮皮片。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人皮膚干細胞活力素的制備方法，其特征在于，皮膚干細胞 的獲取具體為：取健康的新生兒或小兒包皮環(huán)切術(shù)切除的包皮組織，置于含有l(wèi)〇〇U/ml青 霉素和100μg/ml鏈霉素的PBS中，并經(jīng)PBS反復(fù)漂洗后，剪取包皮的全厚皮膚，即皮下組 織剪除后的包皮皮片，PBS漂洗兩次，放入0. 25%Trypsin-EDTA中，剪碎，37°C消化30min， 用200目過濾網(wǎng)過濾細胞，收集濾液；在得到的濾液中加入含有10%FBS的DMEM/F-12完全 培養(yǎng)基，終止反應(yīng)，反復(fù)吹打，用磁珠篩選法篩選出皮膚干細胞。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人皮膚干細胞活力素的制備方法，其特征在于，皮膚干細胞 的接種培養(yǎng)具體為：將得到的皮膚干細胞在轉(zhuǎn)速為1200-1500r/min的條件下離心5min， 用DMEM/F-12完全培養(yǎng)基洗皮膚干細胞1次，調(diào)整細胞密度以2 ~ 5X104個/cm2密度將 皮膚干細胞接種在飼養(yǎng)層細胞上，用DMEM/F-12完全培養(yǎng)基，37°C、5%C02、90%濕度下傳代 擴增培養(yǎng)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人皮膚干細胞活力素的制備方法，其特征在于，所述飼養(yǎng)層 細胞的制備方法包括以下步驟： 511、 將終濃度為0. 25Pg/ml絲裂霉素C加至接近匯合的人成纖維細胞中，37°C過夜，更 換DMEM/F-12完全培養(yǎng)基； 512、 0· 25%Trypsin-EDTA消化，懸液lxlO7個/ml中加入絲裂霉素C，終濃度為2〇μ8/ ml，37°C孵育lh，離心清洗去除絲裂霉素C，再以lxlO5個/ml的人成纖維細胞進行接種； 513、 再培養(yǎng)1~3d后，0· 25%Trypsin-EDTA消化，再接種在新的DMEM/F-12完全培養(yǎng) 基中，接種濃度5xl05個/ml或10 4個細胞/cm2; 514、 繼續(xù)培養(yǎng)1~2d，進行皮膚干細胞接種。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人皮膚干細胞活力素的制備方法，其特征在于，接近匯合的 人成纖維細胞的濃度為lxlO5個/ml。7. 由權(quán)利要求1-6任一項的方法制備的人皮膚干細胞活力素。8. 權(quán)利要求7所述人皮膚干細胞活力素用于制備化妝品的用途。9. 權(quán)利要求8所述的人皮膚干細胞活力素在化妝品上的應(yīng)用，其特征在于，以凍干粉 的形式應(yīng)用，該凍干粉的保護劑為含量為0.2 %- 5 %海藻糖，溶媒為生理鹽水或PBS中的 至少一種，按個人實際情況，確定施用本品方式及用量。10. 權(quán)利要求8所述的人皮膚干細胞活力素在化妝品上的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于精 華液，該精華液的穩(wěn)定保護劑為海藻糖；保濕增稠劑為聚谷氨酸、輔酶Q10以及透明質(zhì)酸中 的至少一種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人皮膚干細胞活力素的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明采用磁珠分選法篩選出皮膚干細胞，用人成纖維細胞為飼養(yǎng)細胞。本發(fā)明的人皮膚干細胞活力素可廣泛應(yīng)用于美容醫(yī)學、護膚、健膚等美容化妝品中。
【IPC分類】A61Q19/08, A61Q19/00, A61K8/98
【公開號】CN105287330
【申請?zhí)枴緾N201510663920
【發(fā)明人】易萍, 倪彥艷, 黃秀艷, 劉璐瑜
【申請人】廣州市科瑋生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年10月15日