以上。因此，選擇0. 7毫升/只為攻毒劑量。
[0022] (3)正式試驗(yàn) 將篩選確定的350只實(shí)驗(yàn)動物，按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為A、B、C、D、E、F和G共七個組，每 組50只。分組情況見表2。
攻毒試驗(yàn)：在預(yù)試驗(yàn)確定攻毒劑量0. 7毫升/只基礎(chǔ)上，7組試驗(yàn)雞只在第18天進(jìn)行 滴鼻攻毒。在各組雛雞攻毒后，停止雞舍供暖，進(jìn)行人為降溫。
[0024] 攻毒36小時后上述的雛雞陸續(xù)發(fā)病，迅速波及全群。在攻毒第2~3天各組雞群 開始發(fā)病，第3天開始癥狀明顯，精神沉郁、嗜眠、畏寒、扎堆、羽毛松亂、垂翅呆立、甩頭、流 涕、噴嚏、喘咳、氣管啰音，夜間癥狀尤為明顯。病死雞剖檢發(fā)現(xiàn)鼻道、氣管、支氣管黏膜腫 脹，內(nèi)有漿液、黏液或干酪樣滲出物；支氣管和氣管交界處有出血，氣管環(huán)出血斑點(diǎn)；氣囊 混濁；腎腫脹，腎小管和輸尿管內(nèi)積滿尿酸鹽；腔上囊和其他臟器未見異常。到第5天A、B、 C三組雞群平均發(fā)病率為94. 7%，死亡率0% ;D、E、F三組雞群平均發(fā)病率為95. 3%，死亡率 0% ;G組雞群發(fā)病率為100%，死亡率0%，發(fā)病率相差不顯著。人工致發(fā)雞傳染性支氣管炎病 例成功。攻毒發(fā)病情況見表3。
[0025]
療效試驗(yàn)：待雞只發(fā)病達(dá)到50%后恢復(fù)供暖，然后給藥。其中，上述的A、B、C三組用納 米聚戊烯醇進(jìn)行治療，給藥劑量依次為〇. 2毫升/只、0. 4毫升/只、0. 6毫升/只；上述的 D、E、F三組用聚戊烯醇進(jìn)行治療，給藥劑量依次為0. 5毫升/只、0. 8毫升/只、1. 2毫升/ 只；Η組為陰性對照組，只攻毒，不給藥。對六4、(：、03、？六組雛雞，進(jìn)行控水12小時后按 照各自劑量要求通過飲水給藥，連用5天。
[0026] 各組隨著用藥時間延長，雞群的病情均有一定程度的好轉(zhuǎn)，尤以A、B、C三組效果 明顯。用藥3天后，各組患雞精神漸顯活潑，食欲好轉(zhuǎn)；5天后呼吸困難得到明顯改善，氣管 啰音減弱，咳嗽減輕；7天后所有臨床癥狀消失，各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)正常。
[0027]
注：1、本表中的觀察時間是指用藥開始觀察，至第7天結(jié)束；2、有效數(shù)和治愈數(shù)每天都 記錄，由于篇幅限制本表中僅以第7天為限；3、療效評價標(biāo)準(zhǔn)：①有效：經(jīng)用藥治療病雞的 精神、采食、飲水出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，咳嗽、打噴嚏和氣管啰音、呼吸困難、腹瀉等癥狀減輕，判定為有 效；②治愈：經(jīng)用藥治療病雞的精神、采食、飲水恢復(fù)正常，不再出現(xiàn)咳嗽、打噴嚏和氣管啰 音、呼吸困難、腹瀉等癥狀者，判定為治愈；③無效：經(jīng)用藥治療病雞的精神、采食、飲水無 好轉(zhuǎn)或有加重趨勢以及死亡者，則判定為無效。
[0028] 表4顯示的有效率、治/自愈率和死亡率的結(jié)果為： (1)有效率：A、B、C三組的有效率分別為96%、100%和100%，平均有效率為98. 67% ; D、 E、F三組的有效率分別為94%、98%和100%，平均有效率為97. 33%。
[0029] (2)治/自愈率：A、B、C三組的治/自愈率分別為96%、98%和100%，平均治/自愈 率為98% ; D、E、F三組的治/自愈率分別為94%、98%和100%，平均治/自愈率為97. 33%。
[0030] (3)死亡率：A、B、C三組的死亡率分別為0· 02%、0%和0%，平均死亡率為0· 007% ; D、E、F三組的死亡率分別為0. 06%、0. 02%和0%，平均死亡率為0. 027%。
[0031] 結(jié)果分析顯示，A、B、C、D、E和F組的療效均明顯優(yōu)于陰性對照組G，呈差異顯著（P <0. 05) ;A、B和C三組與D、E和F組相比也稍好，但差異不顯著（P >0. 05);從劑量與療 效相關(guān)性來看，隨著計(jì)量增加，療效有上升趨勢，但中劑量組與高劑量組的差異也不顯著， 所以從經(jīng)濟(jì)、資源等角度綜合考慮，確定推廣臨床用藥劑量為0. 4毫升/只。
[0032] 實(shí)施例4納米聚戊烯醇亞急性毒性試驗(yàn) 納米聚戊烯醇，純度96%，由項(xiàng)目組生產(chǎn)提供；清潔級Wistar大鼠80只，雌雄各半，體 重110 ±10克，購于山西醫(yī)科大學(xué)動物室。
[0033] 將80只清潔級Wistar大鼠，隨機(jī)分為A、B、C、D四組，每組20只，雌雄各半。
[0034] 將各組Wistar大鼠禁食12小時分別稱重，之后A、B和C三組作為試驗(yàn)組，分別按 1500 mg/b. w、1000 mg/b. w和500 mg/b. w的劑量為各組口服給藥；D組作為對照組，口服 1000 mg/b. w淀粉餾水混懸液。試驗(yàn)時間為28天。分組與處理見表5。
每天觀察記錄受試動物精神狀態(tài)，采食量、飲水量情況，在試驗(yàn)前和試驗(yàn)結(jié)束后對各組 大鼠進(jìn)行稱重、記錄。在試驗(yàn)全過程觀察記錄各組大鼠發(fā)病、死亡數(shù)量。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每 組隨機(jī)剖解4只大鼠，觀察心、肝、脾、肺、腎重量及各組織器官的眼觀變化。
注：1、采食量測定方法為：每天對各組大鼠飼料稱重喂給，在第二天飼喂前要將各組 大鼠飼槽內(nèi)剩余飼料清掃稱重，并在前一天飼料總量中扣除，計(jì)算前一天采食量。2、飲水量 測定方法為：每天對各組加水量進(jìn)行稱重，在第二天加水前要將各組大鼠飼槽內(nèi)剩余水量 吸出稱重，并在前一天加水總量中扣除，計(jì)算前一天飲水量。3、精神狀態(tài)為全程觀察記錄總 體分析結(jié)果。
[0037] 由表6可以看出，經(jīng)28天試驗(yàn)觀察，試驗(yàn)組A、B、C三組和對照組D組大鼠的生長良 好，呼吸、活動正常，飲水、飲食和排便均為正常，口、鼻、眼均無異常分泌物；各組大鼠無發(fā) 病和死亡發(fā)生；各組大鼠的平均采食量和飲水量均無顯著差異（P > 0. 05);各組大鼠的平 均增重差異也不顯著（P > 0. 05)。
[0038]
注：眼觀指標(biāo)：主要觀察大白鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器表面是否光滑、有無充血、出 血斑點(diǎn)；形態(tài)是否正常、有無腫大、結(jié)節(jié)或凹陷突起；切開后是否有質(zhì)地過硬或過軟、有無 充血、出血斑點(diǎn)或結(jié)節(jié)突起等異常情況。
[0039] 由表7可以看出，試驗(yàn)組A、B、C三組和對照組D的心、肝、脾、肺、腎的重量均差異不顯 著（P > 0. 05)。眼觀各臟器均無充、出血斑點(diǎn)；色澤、形態(tài)均為正常，未見各臟器有任何病理 變化。
[0040] 試驗(yàn)結(jié)果表明，納米聚戊烯醇無慢性毒性，臨床使用安全。
[0041] 實(shí)施例5納米聚戊烯醇急性毒性試驗(yàn) 納米聚戊烯醇，純度96%，昆明小白鼠80只，雌雄各半，體重20±2克，購于山西醫(yī)科大 學(xué)實(shí)驗(yàn)動物室。
[0042] 將昆明小白鼠80只隨機(jī)分為A、B、C和D四個組，每組10只，均為雌雄各半。
[0043] 上述的四組小白鼠禁食12小時，將納米聚戊烯醇溶液分別按A組5g/b. w、B組4g/ b. w、C組3g/b. w和D組2g/b. w的劑量經(jīng)口服給藥小白鼠。試驗(yàn)時間為14天。
[0044] 觀察受試動物臨床表現(xiàn)、死亡情況，并每組隨機(jī)剖解2只小白鼠，觀察病理變化。
經(jīng)試驗(yàn)觀察，A、B和C三組小白鼠給藥后飲食、飲水、活力、排便等各項(xiàng)指標(biāo)均與D組 一樣表現(xiàn)正常，試驗(yàn)中所有小白鼠都沒有死亡，并且動物生長良好，呼吸、活動正常，飲水、 飲食和排便均為正常，口、鼻、眼均無異常分泌物。
[0046] 每組隨機(jī)剖解2只，共計(jì)8只小白鼠進(jìn)行觀察，未見各臟器有任何病理變化。
[0047] 由此可見，推薦劑量的10倍量，即5g/kg體重劑量對小鼠無毒害作用。說明納米 聚戊烯醇無急性毒性，臨床使用安全。
[0048] 本發(fā)明人經(jīng)過對比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米聚戊烯醇制劑更容進(jìn)入細(xì)胞，有利于動物吸收， 對治療雞傳染性支氣管炎病效果明顯。并且，長期使用不產(chǎn)生耐藥性，不殘留畜產(chǎn)品，不污 染環(huán)境，建議養(yǎng)雞場在雞傳染性支氣管炎流行季節(jié)可以預(yù)防性的添加使用，以減少雞傳染 性支氣管炎病的危害。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種馬尾松聚戊烯醇提取方法，它包括： 1) 取馬尾松葉粉末，按每l〇〇g加入450-550ml石油醚，70°C，回流提取，重復(fù)提取，合 并提取液，回收溶劑，得到石油醚粗提物； 2) 按每2. 3 -2. 5g上述的石油粗提物中加入濃度為20%wt的氫氧化鈉溶液9-llml， 在70°C溫度下攪拌反應(yīng)1小時，用石油醚萃取，合并石油醚萃取液，水洗至溶液呈中性為 止，減壓濃縮回收溶劑，得到馬尾松葉不皂化物； 3) 馬尾松葉不皂化物中加入丙酮，加熱攪拌溶解后，在0°C條件下靜置4小時，過濾除 去析出物，濾液濃縮回收溶劑后，得聚戊烯醇粗提物； 4) 向上述的聚戊烯醇粗提物中加入濃度為92%wt的乙醇溶液，加熱攪拌溶解后，冷卻 至室溫，靜置分層，吸取上清液，沉淀物加入乙醇溶液，重復(fù)處理5次，得到乙醇不溶物； 5) 向上述的乙醇不溶物中加入丙酮，攪拌溶解后，在_22°C溫度下冷凍，過濾除去濾 液，濾餅加入丙酮，重復(fù)上述操作5次，濾餅濃縮干燥后，得到馬尾松聚戊烯醇。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種馬尾松聚戊烯醇提取方法，其特征在于：步驟5所述的 馬尾松聚戊稀醇，按每l〇g馬尾松聚戊稀醇，加入Tween-80和Span-80混合物15-20g，邊 加入邊攪拌，得到油相；向上述的油相中緩慢加入去離子水，體系短暫渾濁后變澄清，待體 系穩(wěn)定后，在40°C下，邊攪拌邊繼續(xù)加入去離子水轉(zhuǎn)相，體系將由澄清變?yōu)闇啙?，隨后提高 溫度至60°C，用均質(zhì)乳化機(jī)以15000r/min的攪拌速度攪拌15min，體系變?yōu)槌吻?，即?得到聚戊稀醇納米乳液，所述的Tween-80和Span-80混合物，其Tween-80和Span-80的重 量比為0.9-1 : 1。3. 權(quán)利要求1或2所述的馬尾松聚戊烯醇在制備治療雞傳染性支氣管炎藥物中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種馬尾松聚戊烯醇提取方法，包括石油醚提取，氫氧化鈉水解，丙酮、乙醇多次處理，得到馬尾松聚戊烯醇。按每10g馬尾松聚戊烯醇，加入Tween-80和Span-80混合物15-20g，經(jīng)過攪拌、去離子水轉(zhuǎn)相的步驟，得到聚戊烯醇納米乳液。本發(fā)明也提供了一種馬尾松聚戊烯醇在生產(chǎn)治療雞傳染性支氣管炎藥物中的應(yīng)用，試驗(yàn)結(jié)果表明，納米聚戊烯醇和普通聚戊烯醇的有效率分別為98.67%、97.33%；治/自愈率分別為98%、97.33%，可見納米聚戊烯醇療效優(yōu)于普通聚戊烯醇，并且兩者的療效均明顯優(yōu)于陰性對照組。從劑量與療效相關(guān)性來看，隨著計(jì)量增加，療效有上升趨勢，確定推廣臨床用藥劑量為0.4毫升/只。并且納米聚戊烯醇無慢性和急性毒性，臨床使用安全。
【IPC分類】A61P31/12, A61P19/00, A61P11/00, A61K31/047, C08H99/00
【公開號】CN105287444
【申請?zhí)枴緾N201510730630
【發(fā)明人】張玉換, 楊裕, 閆益波, 路佩瑤, 楊春雷
【申請人】山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料獸藥研究所
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月2日