一種抗禽流感病毒轉(zhuǎn)移因子制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗禽流感病毒轉(zhuǎn)移因子制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]禽流感是禽流行性感冒的簡稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型(也稱禽流感病毒)引起的一種急性傳染病，也能感染人類，被國際獸疫局定為甲類傳染病。人感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率約為33 %。此病可通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結(jié)膜等多種途徑傳播，區(qū)域間的人員和車輛往來是傳播本病的重要途徑。
[0003]轉(zhuǎn)移因子(Transfer factor, TF)是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的可透析小分子物質(zhì)-多肽核苷酸復(fù)合物，它能夠特異地將供體的細(xì)胞免疫信息轉(zhuǎn)移給受體正常的淋巴細(xì)胞，從而增強(qiáng)受體的免疫功能?？梢缘挚拐婢⒉《镜确羌?xì)菌性感染，也可以通過白介素與干擾素作用于免疫應(yīng)答過程。畜禽脾臟為加工過程中的廢物，因此有著極大的應(yīng)用前景，已成為轉(zhuǎn)移因子的研究熱點(diǎn)。
[0004]轉(zhuǎn)移因子含多種成分，分子量小于10000，無熱原，無抗原性，無毒副作用，是一種新型而又安全的免疫制劑。轉(zhuǎn)移因子不會被胃蛋白酶、胰蛋白酶分解，也不會被胃酸破壞，可以口服，使用劑量小，起效快，藥效持續(xù)時間長。轉(zhuǎn)移因子作為具有特異性與非特異性的免疫活性細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，可以用于動物病毒性疾病、真菌感染、細(xì)胞免疫減弱或缺陷病以及惡性腫瘤的輔助治療。目前，常規(guī)的制備方法主要是離心、超濾等，容易影響轉(zhuǎn)移因子的活力、回收率低、純度低。因此，需要一種快速、高效并且成本較低的從動物脾臟中獲取轉(zhuǎn)移因子的方法，以滿足目前的工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種抗禽流感病毒轉(zhuǎn)移因子制備方法。以解決現(xiàn)有技術(shù)中相關(guān)方法所制備的轉(zhuǎn)移因子活力較低的技術(shù)問題。
[0006]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是有技術(shù)中相關(guān)方法收率較低。
[0007]為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]—種抗禽流感病毒轉(zhuǎn)移因子制備方法，包括以下步驟進(jìn)行:
[0009]1)原材料的制備:取6月齡豬，用禽流感病毒疫苗皮下注射免疫，2周后，再以同樣方法及劑量免疫一次；二次免疫后15-20天取豬脾臟；
[0010]2)預(yù)處理:去除豬脾臟的筋膜和脂肪組織，洗凈；
[0011]3)破碎:將步驟2)預(yù)處理后的豬脾臟剪碎，加入3倍體積的預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液，用高速組織搗碎機(jī)以1000r/min?2000r/min搗碎3?5次，每次5min，制得勻漿液；
[0012]4)凍融:將步驟3)所得勻漿液置于_80°C冷凍，而后在22°C?37°C水浴條件下融化，交替凍融5?10次；
[0013]5)高壓勻漿:向其中加入表面活性劑，利用高壓均質(zhì)機(jī)在60MPa條件下進(jìn)行細(xì)胞破碎；
[0014]6)提取:向其中加入2?5倍體積的預(yù)冷磷酸鹽緩沖液，4°C條件下以6500?8000r/min速率離心lOmin，取上清；
[0015]7)凝膠色譜分離:將步驟6)所述上清通過微孔濾膜過濾，而后利用凝膠色譜柱分離，收取6000道爾頓以下的物質(zhì)，即為粗產(chǎn)物；
[0016]8)透析:將步驟7)所得粗產(chǎn)物裝入透析袋，于4°C條件下現(xiàn)在0.05M PBS溶液中透析8h?18h，再置于0.01MPBS溶液中透析8h?18h，所得產(chǎn)物即為抗禽流感病毒轉(zhuǎn)移因子。
[0017]優(yōu)選的，步驟7)所述微孔濾膜的孔徑為0.45 μm0
[0018]優(yōu)選的，步驟5)所述表面活性劑是聚山梨酯。
[0019]優(yōu)選的，還包括步驟9):將透析后的產(chǎn)物用孔徑為0.22 μ m的濾膜加壓過濾除菌。
[0020]優(yōu)選的，所述抗禽流感病毒轉(zhuǎn)移因子密封保存于4°C條件下。
[0021 ] 在以上技術(shù)方案中，破壁之前加入表面活性物質(zhì)，益于破壁，且更徹底；采用先免疫后提取的方法，用禽流感病毒免疫豬，以豬脾臟為原料，得到特異性抗禽流感病毒轉(zhuǎn)移因子。本發(fā)明采用了低溫反復(fù)凍融、化學(xué)方法降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、高壓勻漿法、凝膠色譜分離、透析等方法，所得到的目的產(chǎn)物產(chǎn)出率高、純度好、特異性強(qiáng)，且可制備成口服液或者片劑等，便于應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下方面:
[0023](1)原材料來源容易，無污染，價廉等優(yōu)點(diǎn)。豬脾臟和胸腺屬于屠宰后豬的下腳料，為廢棄物。
[0024](2)本工藝采用先免疫后提取的方法，免疫后在抗體水平最高期宰殺，取脾臟、胸腺等，最終得到特異性抗禽流感病毒轉(zhuǎn)移因子。
[0025](3)在提取轉(zhuǎn)移因子過程中用低溫凍融處理，不使小分子物質(zhì)活性喪失，并能夠使禽流感病毒轉(zhuǎn)移因子得以充分的提取。
[0026](4)高壓勻漿前加入表面活性物質(zhì)，可以影響細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而使得裂解更徹底。
[0027](5)本發(fā)明使用凝膠色譜過濾，所得到的轉(zhuǎn)移因子提取物經(jīng)體外活性試驗(yàn)及藥理、毒性試驗(yàn)等證明，具有純度高、免疫活性起效快而維持時間長、易吸收、無不良反應(yīng)等特點(diǎn)。
[0028](6)提高了轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)效率，進(jìn)而降低了成本，傳統(tǒng)的提取方法是通過反復(fù)凍融和離心透析，生產(chǎn)的轉(zhuǎn)移因子原液，每1kg脾臟約生產(chǎn)含量為2.0g/L的原液2L，而采用本發(fā)明生產(chǎn)，每1kg脾臟約生產(chǎn)含量為8.5g/L的原液1L，折合產(chǎn)量增加112.5%
[0029](7)轉(zhuǎn)移因子提取物經(jīng)體外生物活性試驗(yàn)及本產(chǎn)品是一種不含蛋白質(zhì)、只含可溶性的小分子物質(zhì)，分子量在6000道爾頓以下。該提取物可做成各種劑型，如口服劑型、糖漿劑型等，還可通過常規(guī)凍干工藝進(jìn)一步可得到抗禽流感病毒轉(zhuǎn)移因子的粉末，結(jié)合常規(guī)輔料，可制成膠囊、片劑等劑型。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下將對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0031]以下實(shí)施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十(10%)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時修正第一和第二數(shù)值兩個數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。
[0032]除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。
[0033]以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0034]實(shí)施例1
[0035]1、轉(zhuǎn)移因子的制備
[0036](1)用預(yù)冷超純水洗凈豬脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪組織，精確稱量1kg，再用預(yù)冷超純水洗滌干凈。
[0037](2)將洗干凈的豬脾臟用絞肉機(jī)初絞3次，加入3倍體積的預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機(jī)以1000r/min搗碎3次，每次5min，制得勾楽液。
[0038](3)將勻漿液置于_80°C快速冷凍，水浴30°C中融化，交替凍融5次。
[0039](4)向凍融好的勻漿液中加入1 %的表面活性劑，于高壓勻漿機(jī)內(nèi)，壓力60MPa進(jìn)行均質(zhì)，制成勻漿。
[0040](5)向勻漿中加入3倍體積的預(yù)冷磷酸鹽緩沖液，置于冰凍離心機(jī)于4°C以7000r/min, lOmin，取上清。
[0041 ] (6)將上清液通過0.45 μ m的微孔濾膜，流經(jīng)凝膠色譜柱，進(jìn)行分離，收取6000道爾頓以下的小分子物質(zhì)。
[0042](7)將上述粗分離產(chǎn)物經(jīng)透析袋(500道爾頓)，4°C于0.05M PBS中透析12h，再置于0.01MPBS溶液中透析12h。
[0043](8)除菌:將超濾