[0037] 續(xù)選用 Purospher STAR(Merck) RP_18e (5 μ m) 250mmX 4mm 管柱進(jìn)打分析，以 47 : 53的體積比混合乙腈（Acetonitrile，簡(jiǎn)稱ACN)及0.085%的磷酸溶液作為流動(dòng)相，流速 為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm的吸光值，并分析各組總?cè)普伎偯娣e的百分比，紀(jì)錄于第2 表。
[0038] 第2表、各組中草藥萃取物的總?cè)萍岸圊斌w含量。
[0040] 又，另以半乳糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用其濃度及吸光值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。續(xù)配置各組中草 藥萃取溶液，取lmL的各組中草藥萃取物加入lmL的5%酚類溶液，再加入5mL濃硫酸，于靜 置10分鐘后，震蕩使其均勻混合，并利用分光光度計(jì)量測(cè)各組于490nm的吸光值，借助標(biāo)準(zhǔn) 曲線計(jì)算其濃度，其結(jié)果紀(jì)錄于第2表。
[0041] 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，各組中草藥萃取物均富含總?cè)萍岸圊斌w，其中又以第A3組 的含量最1?。
[0042] (B)對(duì)子宮肉瘤細(xì)胞的存活影響
[0043] 本試驗(yàn)是選用人類子宮肉瘤細(xì)胞（MES-SA cells)，購(gòu)自食品工業(yè)發(fā)展研究所 (BCRC60333)，該子宮肉瘤細(xì)胞是培養(yǎng)于含有1.5mM L-麩氨酸（L-Glutamine)及10%胎牛 血清（FBS)的90% McCoy' s5a培養(yǎng)液中，并置于溫度為37°C、二氧化碳濃度為5%及濕度為 95 %的培養(yǎng)箱中，每隔兩天更換一次新鮮培養(yǎng)液。
[0044] 該子宮肉瘤細(xì)胞于繼代培養(yǎng)時(shí)，是先將培養(yǎng)液及細(xì)胞以lOOOrpm離心5分鐘， 去除上清液后，再加入新的培養(yǎng)液，并且使10公分培養(yǎng)皿中維持細(xì)胞數(shù)為約IX 1〇5至 1X106cells/mL〇
[0045] 本試驗(yàn)進(jìn)行時(shí)，是可以取出已經(jīng)長(zhǎng)8~9分滿的上述子宮肉瘤細(xì)胞的10公分培 養(yǎng)皿，去除已變色的培養(yǎng)液，以8mL的PBS緩沖溶液沖洗細(xì)胞一次，加入胰蛋白酶/乙二 胺乙酸（Trypsin/EDTA)反應(yīng)1~3分鐘后，輕搖培養(yǎng)皿使細(xì)胞自壁上脫落，加入已回溫的 培養(yǎng)液，輕輕將細(xì)胞沖散，再將含細(xì)胞的培養(yǎng)液分別置入離心管內(nèi)，以1500rpm離心10分 鐘，除去上清液后，再加入含血清的培養(yǎng)液，使細(xì)胞分散均勻，并取出2 0 μ L的細(xì)胞，加入 20 μ L0. 04%的錐蟲藍(lán)（Trypan Blue)進(jìn)行染色，放入細(xì)胞計(jì)數(shù)器，并于顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì) 胞數(shù)，細(xì)胞存活率必須不小于85%才可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
[0046] 以含血清的培養(yǎng)液將上述子宮肉瘤細(xì)胞的濃度調(diào)整為lxl05Cell/mL，并且各取 100 μ L的該子宮肉瘤細(xì)胞接種于96孔盤，使每個(gè)槽孔含有1x104細(xì)胞，并于溫度為37°C、 二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱進(jìn)行隔夜培養(yǎng)。
[0047] 經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)后，分別加入100 μ L如第3表所示的中草藥萃取物（濃度為2mg/ mL，溶于DMS0中），混合均勻后，于溫度為37°C，二氧化碳濃度為5 %的培養(yǎng)箱續(xù)隔夜培養(yǎng) 24小時(shí)。
[0048] 第3表、本試驗(yàn)各組的細(xì)胞處理?xiàng)l件及存活率。
[0049]
[0050] *存活率的換算公式：「各組之吸光值」/「未經(jīng)任何藥物處理的控制組吸光 值」X 100%。
[0051] 24小時(shí)后，移除培養(yǎng)液，以磷酸緩沖液沖洗后，再加入100 μ L含有CCK-8的新鮮培 養(yǎng)液，置于溫度為37°C，二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱反應(yīng)2小時(shí)后，震搖5分鐘后，檢測(cè)每 個(gè)槽孔于450nm波長(zhǎng)下的吸光值，并依未經(jīng)任何藥物處理的控制組的吸光值結(jié)果計(jì)算存活 率，紀(jì)錄于第3表。
[0052] 請(qǐng)參照第3表所示，依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，該中草藥萃取物確實(shí)具有抑制子宮肉瘤 細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，且是以第A3組中草藥萃取物具有最佳效力，是以續(xù)利用該第A3組中草藥 萃取物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
[0053] (C)對(duì)子宮肉瘤大鼠的影響
[0054] 本試驗(yàn)是選用購(gòu)自財(cái)團(tuán)法人國(guó)家實(shí)驗(yàn)研究院國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的Wistar雌性大 鼠，該些大鼠皆在8周周齡以上，體重介于180~190克之間。該些大鼠是飼養(yǎng)于大仁科技 大學(xué)動(dòng)物中心，維持室溫為20~22°C的動(dòng)物室，光照時(shí)間與黑暗時(shí)間各為12小時(shí)，該些大 鼠可以自由進(jìn)食及飲水。
[0055] 分別經(jīng)胃管將R0水（第C0組）或第A3組中草藥萃取物（第C1組）投予大鼠 (投予劑量為每天每公斤大鼠投予300毫克的中草藥萃取物），同時(shí)通過(guò)腹腔注射投予動(dòng)情 素（劑量為200微克/次），每日紀(jì)錄各組大鼠的體重、攝食量及飲水量，于4周后，自腹腔 動(dòng)脈采血，量測(cè)血液中的動(dòng)情素及黃體素（progesterone)含量，并取出子宮，進(jìn)行組織切 片及H&E染色（hematoxylin-eosin)，其結(jié)果分別如第4表及圖1~4所示。
[0056] 第4表、本試驗(yàn)各組大鼠于28天后的平均體重、攝食量、飲水量，以及血液中的動(dòng) 情素、黃體素含量。
[0058] 請(qǐng)參照第4表，本試驗(yàn)各組的大鼠于28天后的體重、攝食量、飲水量并無(wú)顯著差 異，而投予該中草藥萃取物的第C1組大鼠血液中的動(dòng)情素及黃體素含量則有明顯下降（對(duì) 動(dòng)情素之抑制率達(dá)47. 5±4. 8%，而對(duì)黃體素的抑制率為33. 1±5. 1% )，顯示該中草藥萃 取物確實(shí)具有降低體內(nèi)動(dòng)情素及黃體素含量的能力。
[0059] 續(xù)參照?qǐng)D1及2,分別為第C0組大鼠的子宮、子宮角的組織切片染色結(jié)果，子宮平 滑肌細(xì)胞呈現(xiàn)肥大狀態(tài)（hypertrophy)，具有嗜伊紅性細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞邊界較不清楚、排列交 錯(cuò)、紊亂，且無(wú)法觀察到細(xì)胞有絲分裂現(xiàn)象，顯示已成功誘導(dǎo)使第C0組大鼠形成子宮肌瘤； 又，請(qǐng)參照?qǐng)D3及圖4,第C1組大鼠的組織染色切片結(jié)果顯示，口服該中草藥萃取物可以成 功抑制子宮平滑肌增生及肥大情形，顯示該中草藥萃取物確實(shí)具有改善子宮平滑肌增生、 肥大現(xiàn)象的活性。
[0060] 綜合上述，本發(fā)明的用以抗子宮肌瘤的中草藥組合物，是通過(guò)牛樟芝、黃耆及益母 草的組成配比，降低所需各體體內(nèi)的動(dòng)情素及黃體素含量，可以達(dá)到抑制子宮肌瘤生長(zhǎng)的 功效。
[0061] 再者，本發(fā)明的中草藥萃取物用以制備抗子宮肌瘤藥物的用途，是借助萃取自牛 樟芝、黃耆及益母的活性成分，有效抑制子宮肌瘤的生長(zhǎng)，使患者得以免除子宮肌瘤增長(zhǎng)導(dǎo) 致的痛經(jīng)、不正常出血等病癥，進(jìn)而達(dá)到提升患者生活品質(zhì)的功效。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用以抗子宮肌瘤的中草藥組合物，包含：以重量百分比計(jì)為25~75%的牛樟 芝、20. 8~62. 5%的黃耆，及4. 2~12. 5%的益母草。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中草藥組合物，其特征是，該中草藥組合物包含以重量百分 比計(jì)為75%的牛樟芝。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中草藥組合物，其特征是，該中草藥組合物包含以重量百分 比計(jì)為20. 8%的黃耆。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中草藥組合物，其特征是，該中草藥組合物包含以重量百分 比計(jì)為4. 2%的益母草。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中草藥組合物，其特征是，該中草藥組合物包含以重量百分 比計(jì)為75%的牛樟芝、20. 8%的黃耆，及4. 2%的益母草。6. -種中草藥萃取物用以制備抗子宮肌瘤藥物的用途，其特征是，該中草藥萃取物是 通過(guò)一包含下列步驟的方法所制得： 提供根據(jù)權(quán)利要求1~5項(xiàng)任一項(xiàng)所述的中草藥組合物； 于50~80°C下，以95%酒精萃取該中草藥組合物8~12小時(shí)；及 將萃取產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，以獲得該中草藥萃取物； 其中，該中草藥組合物及該95%酒精的重量體積比為1 :2,該牛樟芝為子實(shí)體，該黃耆 為根部，該益母草為地上部位。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的中草藥萃取物用以制備抗子宮肌瘤藥物的用途，該中草藥萃 取物投予一個(gè)所需個(gè)體，以預(yù)防或改善該所需個(gè)體的子宮肌瘤病癥，其特征是，該中草藥萃 取物投予該所需個(gè)體的劑量為每天每公斤的該所需個(gè)體體重投予300毫克的該中草藥萃 取物，且連續(xù)投予28天。
【專利摘要】本發(fā)明為用以抗子宮肌瘤的中草藥組合物、及其萃取物的用途，公開了一種中草藥組合物，包含：以重量百分比計(jì)為25～75%的牛樟芝、20.8～62.5%的黃耆，及4.2～12.5%的益母草，該中草藥組合物用以預(yù)防及改善子宮肌瘤的癥狀，本發(fā)明另揭示該中草藥組合物的萃取物用以制備抗子宮肌瘤癥狀藥物的用途。
【IPC分類】A61P29/00, A61P15/00, A61K36/533, A61P35/00, A61P7/04
【公開號(hào)】CN105287712
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410297973
【發(fā)明人】李世強(qiáng), 劉崇喜, 劉怡旻, 張家茹
【申請(qǐng)人】康力生技股份有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2014年6月26日