一種基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的禽流感病毒疫苗制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的禽流感病 毒疫苗制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感（Avian Influenza)是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一種禽類(lèi)烈性傳 染病，被國(guó)際獸疫局定為I類(lèi)傳染病。本病發(fā)病急驟，一旦感染將給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì) 損失，成為危害畜牧業(yè)發(fā)展的重大疫病之一。疫苗免疫接種是預(yù)防本病的有效措施。
[0003] 目前大量使用的是雞胚生產(chǎn)的全病毒滅活疫苗，使用礦物油佐劑，利用皮下或肌 肉接種方式免疫動(dòng)物。這種疫苗的生產(chǎn)依賴(lài)于大量的雞胚，并且在新毒株出現(xiàn)的時(shí)候很難 根據(jù)疫情的變化做出迅速的反應(yīng)，且不同毒株之間交叉保護(hù)性較差，這使得疫苗株不得不 經(jīng)常更新，增大了禽流感疫情的防控難度。礦物油佐劑難于吸收，操作難度大。研制一種安 全性好、能夠同時(shí)抵御不同抗原群病毒攻擊的"通用型"禽流感疫苗成為當(dāng)前AIV疫苗研究 的新熱點(diǎn)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)的禽流感疫苗多以禽流感病毒HA蛋白作為抗原，雖然能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中 和抗體，但由于HA易發(fā)生突變，因此難以保證疫苗的有效性。此外，現(xiàn)有技術(shù)的抗原表達(dá)效 率較低，從而限制了制備效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的禽流感 病毒疫苗制備方法，已解決現(xiàn)有技術(shù)疫苗制備方法免疫效果不佳的技術(shù)問(wèn)題。
[0006] 本發(fā)明解決的另一技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)疫苗制備方法因抗原性能不完善從而導(dǎo) 致免疫效果不佳的技術(shù)問(wèn)題。
[0007] 本發(fā)明解決的再一技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)的疫苗制備方法中抗原表達(dá)效率較低。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 一種禽流感疫苗制備方法，包括以下步驟：
[0010] 1)制備含有禽流感病毒HA蛋白和NP蛋白的抗原；
[0011] 2)以步驟1)所述的抗原制備禽流感疫苗。
[0012] 優(yōu)選的，步驟1)具體包括以下步驟：
[0013] a)分別提取禽流感病毒HA蛋白基因和NP蛋白基因；
[0014] b)將步驟a)得到的HA蛋白基因和NP蛋白基因連接到pFastBac Dual載體上得 到重組質(zhì)粒，而后將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，再篩選得到重組穿梭質(zhì)粒 HA-NP-Bacmid ；
[0015] c)將所述重組穿梭質(zhì)粒HA-NP-Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，表達(dá)，取細(xì)胞培養(yǎng)液上 清，即得到含有禽流感病毒HA蛋白和NP蛋白的抗原。
[0016] 優(yōu)選的，所述禽流感病毒是H9N2禽流感病毒。
[0017] 優(yōu)選的，步驟a)中對(duì)HA蛋白基因或NP蛋白基因的提取是先提取其RNA，而后反轉(zhuǎn) 錄得到相應(yīng)的cDNA，再利用PCR方法擴(kuò)增得到HA蛋白基因或NP蛋白基因。
[0018] 優(yōu)選的，步驟c)所述的表達(dá)，是在25~30°C條件下孵育60~96h。
[0019] 優(yōu)選的，步驟b)中所述的篩選，是先后利用卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素進(jìn)行篩 選。
[0020] 優(yōu)選的，步驟c)是利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HA蛋白和NP蛋白。
[0021 ] 優(yōu)選的，所述疫苗的接種方式是滴鼻免疫。
[0022] 優(yōu)選的，所述疫苗的接種劑量是：每羽份中含有20ug NP蛋白和29血凝滴度的HA 蛋白。
[0023] 優(yōu)選的，步驟c)中表達(dá)后，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)取細(xì)胞培養(yǎng)液上清。
[0024] 在以上技術(shù)方案中，步驟2)所述的制備禽流感疫苗，是在利用本發(fā)明所制備的抗 原基礎(chǔ)上，以公知技術(shù)制備疫苗，具體的操作內(nèi)容依照本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)方法執(zhí)行。所述 pFastBac Dual載體是指invitrogen公司出品的pFastBac Dual載體，可自市面購(gòu)得。
[0025] 本發(fā)明以NP蛋白和HA蛋白共同作為疫苗抗原，由于NP蛋白具有高度的保守性， 因此能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉保護(hù)作用，抵抗同型或異型流感病毒的攻擊。在此基礎(chǔ)上，選用桿狀 病毒表達(dá)系統(tǒng)，其基因組大，可容納大片段的目的基因，表達(dá)量高，安全性好，可以對(duì)蛋白進(jìn) 行翻譯后修飾。本發(fā)明意在利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，同時(shí)表達(dá)流感病毒的HA和NP，從而提 供一種新型的安全、有效的流感病毒疫苗。利用本發(fā)明制備的疫苗其免疫效果好，制備效率 高，具有突出的推廣前景。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果圖；圖中，1號(hào)區(qū)域?yàn)?000bp DNA Marker，2號(hào)區(qū)域?yàn)镠A基因，3號(hào)區(qū)域?yàn)?000bp DNA Marker，4號(hào)區(qū)域?yàn)镹P基因。
[0027] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中western-blotting結(jié)果圖；圖中，1號(hào)區(qū)域?yàn)閜rotein marker，2號(hào)區(qū)域?yàn)镹P蛋白，3號(hào)區(qū)域?yàn)閜rotein marker，4號(hào)區(qū)域?yàn)镠A蛋白。
[0028] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中HI抗體檢測(cè)結(jié)果圖。
[0029] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中IFN- γ檢測(cè)結(jié)果圖。
[0030] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中針對(duì)Η9亞型禽流感的ELISA-MVN實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0031] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例1中針對(duì)Η5亞型禽流感的ELISA-MVN實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下將對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過(guò)多不必要的細(xì)節(jié)，在 以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0033] 以下實(shí)施例中所使用的近似性語(yǔ)言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用"大約"、"左右"等語(yǔ)言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn) 確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十（10%)的 范圍內(nèi)變化，比如，"大約1〇〇"表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第 一數(shù)值到第二數(shù)值"的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近 似性語(yǔ)言可能與測(cè)量?jī)x器的精度有關(guān)。
[0034] 除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員普遍理解的相同含義。
[0035] 以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 1、HA和NP基因擴(kuò)增
[0038] 利用RNA提取試劑盒提取流感病毒的RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用各自的引物 經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得流感病毒的HA和NP基因。
[0039] HA引物序列
[0040] 上游：5' -GCGGATCCATGGAAACAATATCACTAATAAC-3' BamH I
[0041] 下游：5' -GCGGTCGACTTATATACAAATGTTGCATCTGC-3' Sal I
[0042] NP引物序列
[0043] h游：5'-CGCCTCGAGATGGCGTCTCAAGGCACCA-3' Xho I
[0044] 下游：5' -CGGCTAGCTTAATTGTCATACTCCTCTGC-3' Nhe I
[0045] 2、重組病毒HA-NP-Bac獲得
[0046] 將 HA 和 NP 基因分別經(jīng) BamH I /Sal I，Xho Ι/Nhe I 酶切，克隆至 pFastBac Dual載體，小量提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行雙酶切（鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1)、PCR和測(cè)序鑒定。鑒定結(jié)果 均為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為pFastBac Dual-HA-NP。將重組質(zhì)粒pFastBac Dual-HA-NP轉(zhuǎn) 化到DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素，慶大霉素和四環(huán)素三重抗生素篩選后，獲得重組穿 梭質(zhì)粒HA-NP-Bacmid。利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，27°C孵育 72h~96小時(shí)，待細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲病毒。將細(xì)胞液以3500r/min離心10min，棄 去細(xì)胞碎肩，所得上清即為pl代病毒原液HA-NP-Bac，利用western-blotting試驗(yàn)鑒定目 的蛋白的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖2。將P1代重組桿狀病毒連續(xù)傳3代，分別檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)及 其表達(dá)量。
[0047] 3、目的蛋白的定量
[0048] 將收獲的3代病毒分別按《中國(guó)獸藥典》方法測(cè)定HA血凝滴度，利用BCA定量試 劑盒說(shuō)明測(cè)定總蛋白濃度，跑SDS-PAGE蛋白膠，利用蛋白純度測(cè)定儀測(cè)定NP蛋白純度，從 而計(jì)算目的蛋白NP的濃度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。
[0049] 表1重組桿狀病毒Bac-HA-NP定量結(jié)果
[0051 ] 4、重組桿狀病毒HA-NP-Bac的擴(kuò)大培養(yǎng)及其純化
[0052] 以P2代重組桿狀病毒為種毒，當(dāng)sf9昆蟲(chóng)