一種載阿霉素的主動靶向白蛋白納米載體的制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗腫瘤的靶向藥物研究領(lǐng)域，具體涉及一種載阿霉素的主動靶向白蛋白納米粒的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥治療的主要目標(biāo)是研制能夠高效殺死腫瘤細(xì)胞的藥物，但對正常組織產(chǎn)生盡可能小的毒性。其中一個提高選擇性和效能的方法就是提高藥物對腫瘤的靶向性?？乖?抗體系統(tǒng)介導(dǎo)的靶向治療主要是利用抗原和抗體之間的特異性識別機制將藥物主動靶向到特定細(xì)胞從而發(fā)揮殺死腫瘤細(xì)胞作用。許多抗體對大多數(shù)腫瘤如肝癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等的特異性抗原都具有識別作用，主要原因在于腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的高表達特點。單克隆抗體作為一種靶向性配體，可以有效識別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的受體。將單克隆抗體與納米粒進行修飾連接之后可利用其特異性的親和力來達到靶向的作用。
[0003]藥物抗體偶聯(lián)物(Antibody Drug Conjugate，ADC)是新一代抗體革E向治療藥物，主要通過化學(xué)偶聯(lián)的方法將細(xì)胞毒性藥物連接到單克隆抗體上，可以靶向到血液系統(tǒng)惡性腫瘤和上皮腫瘤表面抗原，主要用于癌癥和腫瘤的治療。藥物抗體偶聯(lián)物(ADC)的優(yōu)勢是可以有效提高藥物在腫瘤部位的濃度，這樣可以在增強抗腫瘤活性的同時降低對正常組織的毒性和免疫反應(yīng)。目前，已有至少25種藥物抗體偶聯(lián)物(ADC)進入臨床研究，6種用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療，10種用于固體瘤，2種可以靶向到CD70抗原，用于治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)和腎細(xì)胞癌。
[0004]盡管目前ADC中所用到的單抗為人源性或嵌合抗體，但仍然存在免疫原性的風(fēng)險。ADC是一種典型的半抗原-載體抗原，細(xì)胞毒藥物作為其中的半抗原雖然本身沒有免疫原性，但一旦連接到單抗上，會引起動物的一系列免疫反應(yīng)。此外單個的抗體-藥物偶聯(lián)物在腫瘤內(nèi)富集低，化學(xué)偶聯(lián)的藥物在血液循環(huán)中不夠穩(wěn)定，釋放出來的細(xì)胞毒分子對細(xì)胞產(chǎn)生的毒副作用也使得抗體-藥物偶聯(lián)物達不到臨床預(yù)期目標(biāo)。
[0005]本發(fā)明的載阿霉素的主動靶向白蛋白納米粒利用白蛋白二級結(jié)構(gòu)的網(wǎng)狀空隙、靜電力及疏水作用將抗體或抗體-阿霉素偶聯(lián)物吸附連接在納米粒表面，既保有其抗體的主動靶向功能和阿霉素的腫瘤殺傷能力，又利用白蛋白納米粒的生物相容性降低載藥系統(tǒng)的免疫原性和毒性，延長作用時間，降低藥物的毒副作用。本發(fā)明中用到的制備白蛋白納米粒的方法為去溶劑化法，抗體或抗體-阿霉素偶聯(lián)物與白蛋白納米粒的吸附連接來達到主動靶向的載藥系統(tǒng)未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]技術(shù)問題:本發(fā)明提供了一種抗體修飾的具有主動靶向功能的載阿霉素的白蛋白納米粒的制備方法，在白蛋白納米粒表面吸附連接具有靶向性的抗體或抗體偶聯(lián)阿霉素，已克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。
[0007]技術(shù)方案:本發(fā)明載阿霉素的主動靶向白蛋白納米載體的制備，包括如下步驟:
[0008]1)制備濃度為1?5%的白蛋白水溶液，過0.22 μ m濾膜；
[0009]2)將白蛋白水溶液和0.25?2%鹽酸阿霉素溶液混合，調(diào)節(jié)pH8.0?10.0，室溫調(diào)節(jié)下攪拌1?4 ;所述的白蛋白水溶液與鹽酸阿霉素體積比為1: 1?0.2;
[0010]3)以0.3?lml/min速度滴加無水乙醇，水溶液與滴加的無水乙醇的總量的體積比為1: 2?10 ;
[0011]4)加入戊二醛溶液固化12?24h，加入戊二醛與白蛋白的質(zhì)量比為1: 5?20，旋蒸除去乙醇，蒸餾水分散，離心純化，即得載阿霉素的白蛋白納米粒；
[0012]5)不同比例抗體或抗體偶聯(lián)藥物與白蛋白納米粒混合，調(diào)節(jié)pH6.0?10.0，室溫下攪拌3?24h，離心純化，得到的混懸液即為主動靶向的載阿霉素白蛋白納米粒。
[0013]所述的白蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、重組人血清白蛋白或它們的組合；
[0014]步驟2)和5)中調(diào)節(jié)溶液的pH值，優(yōu)選地，通過向水溶液中加入的堿性物質(zhì)為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀中的任意一種或兩種以上的混合物；
[0015]步驟4)和5)中所述離心純化條件為10000?15000rpm，離心時間10?20min，
離心溫度4°C ;
[0016]所述的抗體偶聯(lián)阿霉素，其特征在于，包括下述步驟:
[0017]1) 1 ?10mg/ml 抗體中加入 100 ?500 μ 1 250mM 硼砂/250mM 氯化鈉和 300 μ LlOOmM二硫蘇糖醇(pH 8.0)，37°C孵育30?60min，超濾離心脫鹽，純化還原的抗體，調(diào)整抗體濃度1?4mg/ml ；
[0018]2)向抗體溶液中加入5mg/ml的6-馬來酰亞胺基己酰基-纈氨酸-瓜氨酸-對氨基苯甲酯-阿霉素(MC-Val-Cit-PAB-DOX) /DMF (0.1?1ml，冰上靜置0.5?2h，加入490 μ 1半胱氨酸(10mg/ml，二乙烯三胺五乙酸/PBS)，再靜置45min。超濾離心脫鹽，即得到抗體偶聯(lián)阿霉素；
[0019]所述單克隆抗體為抗EGFR、Her2、CD20、CD40、CD34、CD28、CD13 或 CD22 單抗；優(yōu)選為抗EGFR或⑶20單抗；
[0020]所述的超濾離心純化條件為3000?5000rpm，離心時間10?60min，離心溫度
4°C ；
[0021]所述的納米粒子在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞RK0生長的藥物中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0023]1)本發(fā)明用無毒無刺激的白蛋白納米粒包裹阿霉素可以起到緩釋作用，并在其外部吸附連接抗體或抗體偶聯(lián)藥物，增加了其靶向性和對癌細(xì)胞的殺傷力；
[0024]2)本發(fā)明通過白蛋白的疏水作用和靜電力吸附抗體，不僅可以提高靶向性，還降低了抗體的免疫原性，同時不會阻礙抗體與特異性抗原的結(jié)合位點，保證了抗體的活性。使其能夠持續(xù)高效的進行基因治療作用，這也是本課題的創(chuàng)新之一。
[0025]3)我們選擇了已經(jīng)商品化的并已應(yīng)用于臨床的單克隆抗體，如西妥昔單抗與白蛋白納米球吸附連接，既能起到靶向癌組織的作用，又能競爭性抑制配體與特異性抗原結(jié)合起到治療作用。
【附圖說明】
[0026]圖1為實施例2步驟⑴所得白蛋白納米粒粒徑分布圖
[0027]圖2為實施例2步驟(2)所得西妥昔單抗-二肽阿霉素-白蛋白納米粒粒徑分布圖
[0028]圖3為實施例2細(xì)胞毒性實驗
[0029]圖4為實施例2細(xì)胞攝取實驗
【具體實施方式】
[0030]下面將通過具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但需要指出的是，以下實施例不能構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0031]實施例1
[0032](1)制備載阿霉素納米粒:40mg白蛋白溶于2ml水中，過0.22 μ m濾膜；加入800 μ 1 0.5%鹽酸阿霉素溶液中，再加入0.05mo