(圖 6)。
[0150] 2. 5 BART6-3p低表達的胃癌患者預后較差
[0151] 我們對胃癌組織中BART6-3p的表達與病人的生存時間和狀態(tài)進行的生存分析， 發(fā)現(xiàn)胃癌中BART6-3p的表達與胃癌患者的預后密切相關，BART6-3p高表達（High)的患者 生存時間要明顯長于BART6-3p低表達（Low)的患者（圖7)。
[0152] 實施例3,過表達BART6-3p抑制腫瘤細胞的生長增殖及侵襲轉(zhuǎn)移
[0153] 1.材料方法
[0154] 1.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0155] EBV陰性的鼻咽癌細胞系5-8F、HNE2,胃癌細胞AGS均購自中南大學細胞中心，細 胞培養(yǎng)所用RPMI 1640培基和胎牛血清，及消化細胞所用的胰蛋白酶均為美國Gibco公司 產(chǎn)品。
[0156] BART6_3p由Invitrogen公司通過化學合成法合成，序列為：
[0157] CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA
[0158] 將生長狀態(tài)良好的腫瘤細胞系按2X 105個細胞/孔接種于6孔板中，將6孔板置 于37°(：，5%〇)2培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)細胞生長至50-70%密度即可開始84訂6-3?的轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn) 染過程如下：
[0159] 在無菌EP管中加入8 μ 1的Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑（Qiagen公司產(chǎn)品）于100 μ 1 無血清培養(yǎng)基中混勻靜置5min ;
[0160] 將BART6-3p加入100 μ 1無血清培養(yǎng)基中；然后與上述包含Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑 100 μ 1無血清培養(yǎng)基溫和混勻，室溫靜置30分鐘，使它們形成復合體；
[0161] 用D-Hank' s液洗滌細胞3次；
[0162] 將上述混合物中加入800 μ 1無血清培養(yǎng)基（無抗生素），溫和混勻后加入6孔板 中的1個孔；
[0163] 將6孔板置于C02培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)6小時，然后棄上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù) 培養(yǎng)48小時。
[0164] 1. 2實時定量PCR檢測BART6-3p表達的效果：
[0165] 細胞轉(zhuǎn)染成功后，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量PCR法檢測BART6-3p的表達， 方法和步驟同實施例1。
[0166] 1.3細胞增殖實驗
[0167] MTT實驗[3_ (4, 5-dimethylthiazole_2-yl)-2. 5-dipheny-tetrazolium bromide assay]是檢測腫瘤細胞增殖的常用手段，具體實驗步驟如下：
[0168] 1)將細胞消化，計數(shù)，每孔接種500個細胞于96孔板中，每天需要設置5個復孔最 后求平均值，一共設置5天；
[0169] 2)放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)至少5小時，待細胞貼壁后，加 MTT液（5mg/ml)20yl。繼續(xù)培 養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)液。每孔加入200 μ 1 DMS0,搖床上放置10分鐘；
[0170] 3)選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上，測定各孔吸光度值并記錄結(jié)果，此后每 隔24小時重復步驟2,記錄一次數(shù)值，共計檢測5天；
[0171] 4)實驗重復三次。以各時間點為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制MTT曲線。
[0172] 1.4細胞劃痕實驗
[0173] 細胞劃痕實驗是驗證腫瘤細胞迀移能力的實驗方法。轉(zhuǎn)染了 BART6-3p或?qū)φ?(scramble)序列的鼻咽癌或胃癌細胞接種于6孔板，待細胞密度達到90 %時，用200ul pipet在每個6孔板中劃一條直線（劃痕），隨后在0、8、12、16、24、32、48小時等各個時間 點（視不同細胞迀移能力而定）在顯微鏡下觀察劃痕愈合情況，拍照，并計算各組細胞迀移 速度。
[0174] 1.5細胞穿膜實驗
[0175] 細胞穿膜（(transwell)實驗是驗證腫瘤細胞侵襲能力的實驗方法。Transwell小 室（孔徑8μπι)及基質(zhì)膠（Matrigel)購自美國BD公司，4%多聚甲醛固定液、結(jié)晶紫染液 (0· 1% g/ml)購自Sigma公司。將Matrigel按1:8稀釋，包被在Transwell小室底部膜的 上室面，置37°C 30分鐘使Matrigel聚合成凝膠。使用前按BD公司說明書進行基質(zhì)膠膜水 化。
[0176] 在每個Transwell小室上層加入無血清培養(yǎng)基和1 X 105個轉(zhuǎn)染了 BART6-3p或?qū)?照（scramble)序列的鼻咽癌或胃癌細胞，在Transwell小室下層加入含20%胎牛血清的培 養(yǎng)基。細胞繼續(xù)培養(yǎng)36小時后，用4%多聚甲醛固定液固定，結(jié)晶紫染色，用棉簽輕輕擦掉 上層未迀移細胞，用PBS洗3遍。在顯微鏡下觀察穿過基質(zhì)膠膜的腫瘤細胞。
[0177] 2.結(jié)果
[0178] 2. 1轉(zhuǎn)染BART6-3p后，腫瘤細胞中BART6-3p的表達水平顯著升高
[0179] 在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F、HNE2,胃癌細胞AGS中轉(zhuǎn)染BART6-3p后，BART6-3p 在鼻咽癌和胃癌細胞中的表達均顯著升高（圖8)，表明BART6-3p轉(zhuǎn)染成功。
[0180] 2. 2轉(zhuǎn)染BART6-3p后腫瘤細胞增殖速度減慢
[0181] MTT細胞增殖實驗證實，在鼻咽癌細胞系5-8F、HNE2,胃癌細胞系AGS中轉(zhuǎn)入 BART6-3p后，3株腫瘤細胞的生長增殖速度均明顯減慢（圖9)。
[0182] 2. 3轉(zhuǎn)染BART6-3p后細胞迀移能力減弱
[0183] 細胞劃痕實驗證實，在鼻咽癌細胞系5-8F、HNE2及胃癌細胞AGS中轉(zhuǎn)入BART6-3p 后3株腫瘤細胞從劃痕兩邊往劃痕中央迀移的速度減慢，劃痕愈合的時間延長，表明細胞 運動迀移能力降低（圖10)。
[0184] 2. 4轉(zhuǎn)染BART6-3p后細胞侵襲能力降低
[0185] 細胞穿膜（transwell)實驗證實，在鼻咽癌細胞系5-8F、HNE2及胃癌細胞AGS中 轉(zhuǎn)入BART6-3p后，能穿過基質(zhì)膠膜的腫瘤細胞數(shù)目顯著減少，表明細胞侵襲能力減弱（圖 11) 〇
[0186] 實施例4,過表達BART6-3p抑制腫瘤細胞中IncRNA基因 L0C553103的表達
[0187] 1.材料方法
[0188] 1.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0189] EBV陰性的鼻咽癌細胞系5-8F、HNE2,胃癌細胞AGS均購自中南大學細胞中心，細 胞培養(yǎng)所用RPMI 1640培基和胎牛血清，及消化細胞所用的胰蛋白酶均為美國Gibco公司 產(chǎn)品。
[0190] BART6_3p由Invitrogen公司通過化學合成法合成，序列為：
[0191] CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA
[0192] 在腫瘤細胞中轉(zhuǎn)染BART6-3p的方法和步驟同實施例3。
[0193] 1. 2實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染BART6-3p后IncRNA基因 L0C553103的表達：
[0194] 細胞轉(zhuǎn)染成功后，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量PCR法檢測IncRNA基因 L0C553103的表達，方法和步驟同實施例1，所用引物序列如下：
[0195] 用于實時熒光定量檢測L0C553103表達的引物序列：
[0196] L0C553103 正向引物：5' -acagtagtgcgatcaaggct-3'
[0197] L0C553103 反向引物：5' -tcaccacctccctgttcttc-3'
[0198] 內(nèi)參基因 GAPDH特異性PCR引物：
[0199] 正向引物 5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '
[0200] 反向引物 5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
[0201] 2.結(jié)果
[0202] 轉(zhuǎn)染BART6-3p后，腫瘤細胞中L0C553013的表達水平顯著降低
[0203] 在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F、HNE2,胃癌細胞AGS中轉(zhuǎn)染BART6-3p后，IncRNA 基因 L0C553103的表達均顯著降低（圖12)，表明BART6-3p可抑制L0C553010的表達，或者 說IncRNA基因 L0C553103是BART6-3p的靶基因。
[0204] 實施例5，RNA干擾法抑制腫瘤細胞中L0C553103的表達可以抑制腫瘤細胞的生長 增殖及侵襲轉(zhuǎn)移
[0205] 1.材料方法
[0206] 1. 1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0207] 鼻咽癌細胞系5_8F、HNE2,胃癌細胞AGS均購自中南大學細胞中心，細胞培養(yǎng)所用 RPMI1640培基和胎牛血清，及消化細胞所用的胰蛋白酶均為美國Gibco公司產(chǎn)品。
[0208] 特異性針對L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)如下：
[0209] siRNA-Ι :5, -AUAACAUGACAGCUUGCUU⑶CUCC-3，
[0210] siRNA-2 :5' -CUUCCAAGCUCACUCAAGGUUGUUG-3'
[0211] siRNA-3 :5' -CUAAUAUUCCCUCAGAGCUGGGCUG-3，
[0212] 上述特異性針對L0C553103的RNA干擾序列由Invitrogen公司合成，陰性對照 (NC，scramble)序列也由Invitrogen公司合成并提供。
[0213] 細胞轉(zhuǎn)染的方法和步驟同實施例3.
[0214] 1. 2 RNA干擾L0C553103的表達后，通過細胞增殖實驗、細胞穿膜實驗和細胞劃痕 實驗檢測了人為下調(diào)L0C553103表達后細胞的生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化。具體方 法和步驟同實施例3.
[0215] 2.結(jié)果
[0216] 2. 1轉(zhuǎn)染特異性針對L0C553103的RNA干擾序列后，腫瘤細胞中L0C553103的表達 水平顯著降低
[0217] 在鼻咽癌細胞5-8F、HNE2,胃癌細胞AGS中轉(zhuǎn)染特異性針對L0C553103的RNA干擾 序列后，L0C553103在上述細胞中的表達均顯著降低（圖13)，表明針對L0C553103的RNA 干擾序列轉(zhuǎn)染成功，抑制L0C553103表達的效果明顯。
[0218] 2. 2干擾L0C553103表達后腫瘤細胞增殖速度減慢
[0219] MTT細胞增殖實驗證實，在鼻咽癌細胞系5-8F、HNE2,胃癌細胞系AGS中轉(zhuǎn)入特異 性針對L0C553103的RNA干擾序列后，3株腫瘤細胞的生長增殖速度均明顯減慢（圖14)。
[0220] 2. 3干擾L0C553103表達后細胞迀移能力減弱
[0221 ] 細胞劃痕實驗證實，在鼻咽癌細胞系5-8F、HNE2及胃癌細胞AGS中轉(zhuǎn)入特異性針 對L0C553103的RNA干擾序列后鼻咽癌和胃癌細胞從劃痕兩邊往劃痕中央迀移的速度減 慢，劃痕愈合的時間延長，表明細胞運動迀移能力降低（圖15)。
[0222] 2. 4干擾L0C553103表達后細胞侵襲能力降低
[0223] 細胞穿膜（transwell)實驗證實，在鼻咽癌細胞系5-8F、HNE2及胃癌細胞AGS中 轉(zhuǎn)入特異性針對L0C553103的RNA干擾序列后，能穿過基質(zhì)膠膜的腫瘤細胞數(shù)目顯著減少， 表明細胞侵襲能力減弱（圖16)。
[0224] 實施例6,在動物模型中進一步證實過表達BART6-3p或用RNA干擾法抑制腫瘤細 胞中L0C553103的表達可以抑制腫瘤細胞的生長增殖及侵襲轉(zhuǎn)移
[0225] 1.材料方法
[0226] 1. 1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0227] 鼻咽癌細胞系5-8F購自中南大學細胞中心，細胞培養(yǎng)所用RPMI 1640培基和胎牛 血清，及消化細胞所用的胰蛋白酶均為美國Gibco公