miR-18a-5p抑制劑在制備防治骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種miR-18a-5p抑制劑在制備防治骨質(zhì)疏 松藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis, 0P)是由多種原因引起的，以單位體積內(nèi)骨組織量減 少、骨密度降低為標(biāo)志的全身性、進(jìn)行性、代謝性骨病。0P分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，原發(fā)性 0P又分為I型絕經(jīng)后0P和II型老年性0P。在所有的0P患者中，均出現(xiàn)單位體積內(nèi)骨組 織量（BV/TV)降低，骨礦密度（BMD)降低，骨微結(jié)構(gòu)破壞的現(xiàn)象。在老齡化不斷加劇的中國(guó) 社會(huì)，0P已經(jīng)成為威脅老年人健康，降低生活質(zhì)量的重要因素。
[0003] 破骨細(xì)胞（Osteoclast, 0C)由造血干細(xì)胞系髓系單核細(xì)胞分化而來(lái)，是人體骨 骼系統(tǒng)中唯一具有吸收和重塑骨骼形態(tài)功能的生理性多核巨細(xì)胞。在0C的分化過(guò)程中， RANKL和M-CSF是最重要的兩種細(xì)胞因子。在骨吸收過(guò)程中，0C能夠酸化其細(xì)胞外的微環(huán) 境至pH3. 0-4. 0。0C的活性和數(shù)量與人體正常生理穩(wěn)態(tài)電解質(zhì)平衡中的鈣磷平衡及諸多內(nèi) 分泌疾病包括骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，0P患者中破骨細(xì)胞活性明顯提高，噬骨活 動(dòng)增加，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞耦連作用下降，最終導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，骨生理穩(wěn)態(tài)遭到 破壞，骨密度下降。
[0004] 微小RNA (microRNA，簡(jiǎn)稱miRNA)是生物體內(nèi)源長(zhǎng)度約為15-22個(gè)核苷酸的非編碼 小RNA，通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA 的降解或翻譯抑制。目前只有一小部分miRNAs生物學(xué)功能得到闡明，這些miRNAs具有調(diào) 節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，組織分化的功能，與生命過(guò)程中發(fā)育、疾病有關(guān)。近些年來(lái)越來(lái)越多的研究表 明，miRNAs在骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育及骨穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要功能，部分miRNAs甚至可以作為骨 相關(guān)疾病的生物學(xué)標(biāo)志。
[0005] 目前，關(guān)于miR-18a的研究主要集中在胃癌標(biāo)志物，細(xì)胞的增殖與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 等方面，其在骨骼系統(tǒng)中的作用鮮有研究，尚未見(jiàn)關(guān)于miR-18a-5p抑制劑在制備防治骨質(zhì) 疏松方面的任何報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種miR-18a_5p抑制劑在制備防治骨質(zhì)疏松 藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0008] l、miR-18a_5p抑制劑在制備防治骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。
[0009] 優(yōu)選的，miR-18a_5p抑制劑通過(guò)下調(diào)miR-18a_5p的表達(dá)，解除miR-18a_5p對(duì) LXR-β基因表達(dá)的抑制，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)防治骨質(zhì)疏松的目的。
[0010] 優(yōu)選的，所述miR-18a-5p抑制劑包含如SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列片段。
[0011] 優(yōu)選的，所述miR-18a-5p抑制劑為包含如SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列的質(zhì)粒或 轉(zhuǎn)化體。
[0012] 優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)化體為腺病毒、慢病毒或噬菌體。
[0013] 2、miR-18a_5p抑制劑在抑制破骨細(xì)胞分化中的應(yīng)用。
[0014] 優(yōu)選的，所述miR-18a_5p抑制劑通過(guò)下調(diào)miR-18a_5p的表達(dá)，解除miR-18a_5p 對(duì)LXR- β基因表達(dá)的抑制，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞分化。
[0015] 優(yōu)選的，所述miR-18a-5p抑制劑包含如SEQ ID Ν0. 2所示的核苷酸序列片段。
[0016] 優(yōu)選的，所述miR-18a-5p抑制劑為包含如SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列的質(zhì)?；?轉(zhuǎn)化體。
[0017] 優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)化體為腺病毒、慢病毒或噬菌體。
[0018] 本發(fā)明采用小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264. 7細(xì)胞，在RANKL以及MCSF的刺激誘導(dǎo) 下向破骨細(xì)胞分化，通過(guò)microarray檢測(cè)miRNAs的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-18a_5p在破骨細(xì) 胞分化中表達(dá)明顯上調(diào)。為進(jìn)一步驗(yàn)證，將原代小鼠骨髓單核細(xì)胞分離并通過(guò)RANKL以及 MCSF的刺激誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化，使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)原代小鼠骨髓單核細(xì)胞 向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中miR-18a-5p的表達(dá)情況。結(jié)果提示誘導(dǎo)分化24h后miR-18a-5p表 達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在小鼠原代單核細(xì)胞破骨分化過(guò)程中施加 pre-miR-18a-5p， 人為上調(diào)miR-18a-5p的表達(dá)后，破骨細(xì)胞分化效果顯著提升。提示miR-18a-5p能夠促進(jìn) 破骨細(xì)胞分化成熟。
[0019] 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明將miR-18a_5p抑制劑轉(zhuǎn)染入小鼠原代骨髓單核細(xì)胞后通 過(guò)RANKL以及MCSF誘導(dǎo)破骨分化，通過(guò)TRAP染色以及檢測(cè)破骨細(xì)胞分化的指標(biāo)判斷 miR-18a-5p對(duì)細(xì)胞破骨分化的影響。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-18a-5p抑制劑實(shí)驗(yàn)組TRAP強(qiáng) 度明顯下降，同時(shí)標(biāo)志破骨分化的Calcitonin Receptor等標(biāo)志物表達(dá)均下調(diào)，融合分子 DC-STAMP、ATP6v0d2等也有明顯下調(diào)。
[0020] 為了探討miR-18a-5p抑制成骨細(xì)胞分化的可能分子機(jī)制，本發(fā)明通過(guò) Targetscan對(duì)miR-18a-5p的潛在革E1基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并從預(yù)測(cè)結(jié)果中篩選出了可能與 miR-18a-5p抑制破骨細(xì)胞分化功能相關(guān)的候選靶基因一一LXR-beta。之后本發(fā)明設(shè)計(jì)了 相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證LXR-beta是否是miR-18a-5p的靶基因。轉(zhuǎn)染miR-18a-5p模擬物后發(fā) 現(xiàn)LXR-beta在mRNA水平變化不大，而在蛋白水平發(fā)生了顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-18a-5p抑 制劑后，LXR-beta的表達(dá)水平有所升高，說(shuō)明miR-18a_5p通過(guò)直接靶向并下調(diào)LXR-beta促 進(jìn)破骨細(xì)胞分化，而其抑制劑可以抑制破骨細(xì)胞分化、抑制骨鈣丟失。
[0021] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明采用小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264. 7細(xì)胞， 在RANKL以及MCSF的刺激誘導(dǎo)下向破骨細(xì)胞分化，通過(guò)檢測(cè)miRNAs的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn) miR-18a-5p在破骨細(xì)胞分化中表達(dá)明顯上調(diào)；將miR-18a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染入小鼠原代骨髓 單核細(xì)胞后通過(guò)RANKL以及MCSF誘導(dǎo)破骨分化，并通過(guò)TRAP染色以及檢測(cè)破骨細(xì)胞分化 的指標(biāo)判斷miR-18a-5p對(duì)細(xì)胞破骨分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-18a-5p抑制劑實(shí)驗(yàn)組 TRAP強(qiáng)度明顯下降，同時(shí)標(biāo)志破骨分化的Calcitonin Receptor等標(biāo)志物表達(dá)均下調(diào)，融 合分子DC-STAMP、ATP6v0d2等也有明顯下調(diào)，這表明miR-18a-5p抑制劑可以抑制破骨細(xì)胞 分化、抑制骨鈣丟失，進(jìn)而一定程度起到防治骨質(zhì)疏松的作用。因此，本發(fā)明為防治骨質(zhì)疏 松提供了新的研究方向。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0023] 圖1 microarray芯片檢測(cè)RAW264. 7細(xì)胞破骨分化過(guò)程中miRNAs表達(dá)情況，R(+) 表示經(jīng)過(guò)RANKL和M-CSF誘導(dǎo)，R(-)為對(duì)照組。
[0024] 圖2熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠原代骨髓單核細(xì)胞破骨分化過(guò)程中miR-18a_5p 的表達(dá)結(jié)果，其中，RANKL (+)表示經(jīng)過(guò)RANKL和M-CSF誘導(dǎo)，RANKL (-)為對(duì)照組。
[0025] 圖3轉(zhuǎn)染miR-18a-5p模擬物和miR-18a-5p抑制劑對(duì)于RAW264. 7細(xì)胞破骨分化 的影響，其中，RANKL(+)表示經(jīng)過(guò)RANKL和M-CSF誘導(dǎo)，RANKL(-)為對(duì)照組，pre-miR-18a 表示轉(zhuǎn)染miR_18a_5p模擬物組，anti-miR_18a表示轉(zhuǎn)染miR-18a_5p抑制劑組。
[0026] 圖4轉(zhuǎn)染miR-18a_5p抑制劑抑制破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的熒光實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)結(jié)果。圖A-F依次為基因 c-FOS、Ctsk、DC-STAMP、NFATcl、TRAP和NFKB的表達(dá)結(jié)果。 pre組表示miR-18a_5p模擬物組、anti組表示miR-18a_5p抑制劑組，preNC組和antiNC 組分別為其各自的對(duì)照組（對(duì)照是無(wú)影響的堿基片段）。
[0027] 圖5雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)LXR-beta是miR-18a_5p靶基因結(jié)果圖，pre-miR_18a表 示轉(zhuǎn)染miR-18a-5p模擬物組，anti-miR-18a表示轉(zhuǎn)染miR-18a-5p抑制劑組，NC組為對(duì)照 組。其中，A圖為對(duì)miR-18a與Nrlh2(LXR-f3)的3' -UTR結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)，B圖為雙熒光報(bào) 告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果的證實(shí)。
[0028] 圖6 Westen blot驗(yàn)證LXR-beta是miR-18a_5p革巴基因，pre組表不轉(zhuǎn)染 miR-18a_5p模擬物組，anti組表示轉(zhuǎn)染miR-18a_5p抑制劑組，preNC組和antiNC組為對(duì) 照組。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限 定。
[0030] 小鼠原代骨髓單核細(xì)胞（Bone Marrow Monocytes, BMMs)由小鼠長(zhǎng)骨骨髓細(xì)胞分 離而來(lái)，在RANKL以及MCSF的刺激誘導(dǎo)下可以向破骨細(xì)胞分化，是研究破骨細(xì)胞分化，融 合，成熟，噬骨等生物學(xué)行為的常用原代細(xì)胞模型。同時(shí)破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、基質(zhì) 細(xì)胞等都有密切的關(guān)聯(lián)和耦合作用，是體內(nèi)骨穩(wěn)態(tài)、電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及促進(jìn)骨形成的重要調(diào) 控元素。骨質(zhì)疏松往往由過(guò)多的骨吸收導(dǎo)致，是破骨細(xì)胞過(guò)度活化的結(jié)果。故選擇小鼠骨 髓單核細(xì)胞作為細(xì)胞模型進(jìn)行相關(guān)研究。
[0031] 本文所述miR-18a_5p模擬物為miR-18a_5p的替代品，其作用類似于miR-18a_5p。
[0032] 1、破骨細(xì)胞分化過(guò)程中miRNA表達(dá)情況檢測(cè)
[0033] 首先體外誘導(dǎo)小鼠原代骨髓單核細(xì)胞破骨分化，操作步驟如下：
[0034] 將小鼠原代骨髓單核細(xì)胞RAW264. 7細(xì)胞以1 X 103個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞 長(zhǎng)滿后棄掉培養(yǎng)基，同時(shí)分別以終濃度50ng/mL的RANKL和M-CSF誘導(dǎo)小鼠原代骨髓單核 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，以普通培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1 %雙抗）作為對(duì) 照。誘導(dǎo)72h后即可見(jiàn)多核（核數(shù)量大于3)的破骨細(xì)胞形成。培養(yǎng)基成分優(yōu)選為DMEM高 糖培養(yǎng)液+10 %胎牛血清+1 %雙抗（青鏈霉素）。
[0035] 將上述獲得的破骨細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，步驟如下：
[0036] 收獲破骨細(xì)胞時(shí)，加入1ml TRIZ0L裂解細(xì)胞并用吸管反復(fù)吹吸5min，然后將細(xì)胞 轉(zhuǎn)至1. 5ml離心管中，并加入0. 2ml氯仿，漩禍振蕩器上用力震搖15s，然后室溫放置3min， 4°C、12, OOOXg離心15min，再將占總體積約60%的無(wú)色上層水相轉(zhuǎn)移至新的1. 5ml管中， 加入0· 5ml異丙醇，混勾，室溫作用10min，4°C、12, OOOXg離心10min，棄去上清，加入lml 體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇（DEPC水配置）洗滌沉淀，震蕩，4°C、7,500Xg離心5min，棄上清，將 沉淀于37°C干燥5~lOmin，加入30 μ 1 DEPC水重新溶解，貯存于-70°C或直接使用。
[0037] RNA提取完畢后用microarray芯片檢測(cè)破骨細(xì)胞分化過(guò)程中miRNA表達(dá)情況，檢 測(cè)由博奧生物（上海）完成，運(yùn)用Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，共檢測(cè)小鼠的1191種miRNA， 其中，P值小于〇. 05,且變化倍數(shù)多2的miRNA被認(rèn)為是顯著變化的miRNA，這其中便包括 miR-18a-5p，其在破骨細(xì)胞分化的72h和192h與對(duì)照組相比均顯著上調(diào)（圖1)。
[0038] 根據(jù)所得microarray芯片結(jié)果，使用Ambion公司的小RNA試劑盒（Taqman MicroRNA Assay)，根據(jù)試劑盒操作手冊(cè)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù) 檢測(cè)小鼠原代單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化不同時(shí)