聚合物的生物穩(wěn)定性和生物相容性與從SNAP釋放NO組合使該制劑有吸引力地用于其它體 外和可能的生物醫(yī)療應(yīng)用。
[0039] SNAP/E2As制劑的長(zhǎng)期N0釋放 用SNAP/E2AS膜進(jìn)行體外研究，以檢驗(yàn)從這些膜的長(zhǎng)期N0釋放和SNAP浸出。根據(jù)聚 合物相內(nèi)分解的SNAP的量測(cè)定隨時(shí)間從SNAP/E2As膜釋放NO ( 即，通過測(cè)定在指定時(shí)間點(diǎn) 溶解膜后剩余的SNAP)。10%重量膜中SNAP的初始濃度為420nmol SNAP/mg膜。圖5A顯 示1. OmM SNAP溶液、再溶于N，N-二甲基乙酰胺（DMAc)的E2As膜中10%重量SNAP和溶于 DMAc 的 E2As 的 UV-vis 光譜。
[0040] 由于SNAP熱和/或光化學(xué)分解，在10%重量SNAP/E2As膜在不同條件下浸入PBS 時(shí)，觀察到在340nm吸收帶減小，基于吸收度減小的累積NO釋放顯示于圖5B中。10%重量 SNAP/E2As膜在第一天浸漬期間顯示初始突發(fā)NO (見圖3A和3B)，相當(dāng)于熱分解和SNAP擴(kuò) 散出膜。在室溫浸漬的膜具有最低NO釋放通量。然而，在37°C在暗處或在環(huán)境光下培育的 膜顯示高于在室溫膜的NO釋放。這是由于增加的SNAP熱分解。暴露于環(huán)境光的膜顯示得 到與在暗處浸漬的膜基本相同的NO釋放曲線。由于其快速耗盡SNAP貯庫(kù)的較高NO通量， 從在37°C用100W泛光燈連續(xù)照射的SNAP/E2As膜的氧化氮釋放只在3天內(nèi)釋放NO。這些 膜通過SNAP的熱分解和光引發(fā)分解二者提供NO釋放。
[0041] 可在聚合物相內(nèi)或者在SNAP通過擴(kuò)散出聚合物進(jìn)入水相后，出現(xiàn)由SNAP的熱和/ 或光化學(xué)分解從SNAP摻雜E2As釋放氧化氮。為了更好地理解SNAP/E2As涂層的N0釋放 機(jī)制，經(jīng)20天時(shí)間監(jiān)測(cè)SNAP擴(kuò)散進(jìn)入PBS。如圖6A中所示，在37°C包含10%重量SNAP的 膜顯示在第一天初始突發(fā)SNAP浸出。在此初始突發(fā)后，SNAP繼續(xù)從E2As緩慢擴(kuò)散，直至 SNAP貯庫(kù)接近耗盡（在第20天仍有可檢測(cè)量的SNAP)。在20天期間，從膜浸出的SNAP的 總量占總釋放N0的約27%(通過Ν0Α測(cè)定檢測(cè)）（見圖6B)。
[0042] 另外，也評(píng)價(jià)聚合物面涂層數(shù)對(duì)SNAP損失的影響。沒有任何面涂層的SNAP摻雜 E2As膜顯示比具有至少2個(gè)面涂層的膜更高水平的SNAP擴(kuò)散進(jìn)入緩沖劑（見圖7)。面涂 層的厚度允許控制SNAP從聚合物貯庫(kù)的擴(kuò)散速率。因此，在本文所公開的實(shí)例中，可用聚 合物面涂層涂覆SNAP摻雜膜。用于面涂層的適合聚合物的實(shí)例包括硅氧烷基聚氨酯彈性 體、聚（氯乙烯），交聯(lián)聚氨酯、交聯(lián)硅橡膠、聚四氟乙烯等（其中沒有N0供體）。在一些實(shí) 例中，用于面涂層的聚合物為用于下面的膜的相同聚合物。
[0043] SNAP/E2As臘的穩(wěn)宙件研究 也評(píng)價(jià)在干燥儲(chǔ)存期間E2As聚合物中摻雜的SNAP的穩(wěn)定性。E2As中加入的SNAP可 在儲(chǔ)存期間潛在經(jīng)歷熱或光化學(xué)分解，因此，限制使用時(shí)可用的N0釋放能力。因此，利用干 燥劑在冷凍器中在暗處、在暗處或在環(huán)境光利用干燥劑在室溫干燥和在暗處利用干燥劑在 37°C和50°C干燥儲(chǔ)存10%重量SNAP/E2As膜。這些穩(wěn)定性研究也用與累積N0釋放試驗(yàn)類 似的方式進(jìn)行，其中使膜溶于DMAc，以測(cè)定在不同時(shí)間點(diǎn)聚合物中剩余的SNAP的量（如本 文所述）。結(jié)果表明，在4個(gè)月后，SNAP在E2As聚合物基質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定。例如，與在室溫儲(chǔ)存的 膜保持89%和在37°C儲(chǔ)存的膜保持82%比較，在2個(gè)月后，在冷凍器（_20°C )中在暗處儲(chǔ) 存的10%重量SNAP膜保持約96%的初始SNAP物類（見圖8)。表8中所示結(jié)果說明在儲(chǔ)存 期間SNAP的提高穩(wěn)定性。由于圍繞硫原子的空間位阻，叔RSN0,例如SNAP，具有比伯RSN0 更大的穩(wěn)定性。SNAP的提高熱穩(wěn)定性與E2As聚合物的穩(wěn)定作用組合提供SNAP/E2As材料 的極佳儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
[0044] 已關(guān)于包含這些N0供體的不同聚合物基質(zhì)研究RSN0的穩(wěn)定性，包括聚乙二醇、 Pluronic? F127水凝膠、聚（乙烯醇）和聚（乙烯吡咯烷酮）。RSN0按照以下反應(yīng)次序分 解： RSN0 - RS · + N0 · (1) RS · + RSN0 - RSSR + NO · (2) 總反應(yīng)：2RSN0 - RSSR + 2N0 · (3) 聚合物基質(zhì)的粘度提供對(duì)鍵裂和自由基對(duì)重組的籠效應(yīng)。另外，粘性聚合物基質(zhì)也限 制自由基物類擴(kuò)散，這有利于雙重組，再生成RSN0。因此，E2As聚合物不僅限制SNAP擴(kuò)散 進(jìn)入PBS，而且似乎提供另外的穩(wěn)定作用，以減小SNAP分解速率。
[0045] 進(jìn)行試驗(yàn)以檢驗(yàn)E2A基質(zhì)中SNAP的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。圖9顯示所述結(jié)果。具體地講， 圖9顯示從在37°C在暗處E2As干燥膜中10%重量SNAP的N0釋放性質(zhì)（n=l)。使膜在37°C 干燥，然后在37°C儲(chǔ)存。在第一小時(shí)儲(chǔ)存期間釋放膜中總NO的約5%，隨后是很低水平的NO 釋放。這對(duì)應(yīng)于本文中公開的其它儲(chǔ)存/穩(wěn)定性數(shù)據(jù)（見圖8)，其顯示在37°C干燥儲(chǔ)存期 間SNAP緩慢失去其N0(在干燥狀態(tài)儲(chǔ)存兩個(gè)月后只失去10-15%的SNAP)。
[0046] SNAP/E2As涂覆ECC回路和對(duì)兔血流動(dòng)力學(xué)的影響 制備用E2As中5%重量SNAP和E2As面涂層涂覆的活性ECC回路（其示意橫截面顯示 于圖10中）和只用E2As涂覆的對(duì)照回路。部分由于ECC試驗(yàn)的短持續(xù)時(shí)間，在這些試驗(yàn) 中使用5%重量SNAP。如上所述，SNAP/E2As涂層在第一天浸漬期間SNAP初始突發(fā)擴(kuò)散進(jìn) 入溶液。為了減小短期ECC試驗(yàn)期間這種突發(fā)的影響，所有回路首先在鹽水中浸漬過夜，并 在ECC試驗(yàn)前棄去浸漬溶液。在血液暴露前（在鹽水中浸漬過夜后），關(guān)于N0釋放用Ν0Α 測(cè)定從經(jīng)涂覆ECC回路樣品釋放的氧化氮。SNAP/E2As涂覆回路的N0釋放保持約2x10 wmol cm 2 min 1的平均通量4小時(shí)（在37°C利用環(huán)境光）（見圖11A)。在暴露于流動(dòng)血液 4小時(shí)后，ECC回路仍經(jīng)另外1小時(shí)時(shí)間顯示至少1. 5x10 1() mol cm 2 min 1的N0通量（見 圖 11B)。
[0047] 也在兔ECC模型中經(jīng)4小時(shí)血液暴露監(jiān)測(cè)SNAP/E2As涂覆ECC回路的血流動(dòng)力學(xué) 作用。對(duì)于SNAP/E2AS和對(duì)照回路二者，平均動(dòng)脈壓（MAP)在第1小時(shí)內(nèi)顯著下降，分別下 降到35±2mmHg和46±2mmHg。通過連續(xù)IV流體維持，MAP保持在這些水平4小時(shí)。對(duì)于 SNAP/E2As ECC，ECC血流量下降并保持在64±5mL/min，而對(duì)于對(duì)照，在4小時(shí)內(nèi)保持在基 線水平（76±6mL/min)。對(duì)于SNAP/E2As回路，MAP下降和較慢血流量可能是由于SNAP從 涂層擴(kuò)散進(jìn)入血液的血管擴(kuò)張效應(yīng)。心率在4小時(shí)內(nèi)保持，且沒有注意到在SNAP/E2As和 對(duì)照ECC回路之間有顯著差異，平均為205±2次搏動(dòng)/min。對(duì)于SNAP/E2As和對(duì)照回路兩 者，活化凝固時(shí)間均在4小時(shí)內(nèi)增加，這可能是由于血管內(nèi)流體增加（血液稀釋效應(yīng)）。已 用SNAP灌注觀察到對(duì)MAP和流速的類似影響。
[0048] SNAP/E2As涂層對(duì)兔血小板功能和血栓形成的影響 通過記錄血小板計(jì)數(shù)（例如，消耗，見圖12A)和血漿纖維蛋白原水平（見圖12B)評(píng)價(jià) 在整個(gè)4小時(shí)ECC的血小板活化和功能，兩者由于增加的IV流體和％血小板聚集均對(duì)血液 稀釋校正。對(duì)于5%重量SNAP/E2As和E2As對(duì)照回路，基線血小板計(jì)數(shù)（xl0s個(gè)血小板/ mL)分別為3. 5±0. 6和4. 8±0. 5。對(duì)于SNAP/E2As回路，血小板計(jì)數(shù)最初略微上升，并在 ECC上在4小時(shí)結(jié)束保持在基線水平的100±7%。對(duì)照回路的血小板計(jì)數(shù)顯示血小板的時(shí) 間依賴性損失，4小時(shí)后下降到基線的60±6%。通過PRP先體外后體內(nèi)膠原蛋白刺激并通 過光學(xué)濁度測(cè)定血小板功能聚集的百分?jǐn)?shù)。在4小時(shí)血液暴露期間，通過SNAP/E2As和對(duì) 照回路從循環(huán)所取血液的血小板顯示類似對(duì)膠原蛋白刺激血小板聚集的響應(yīng)，兩者均保持 56 ± 12% (基線值在 68 ± 6%)。
[0049] 如圖12B中所示，對(duì)于對(duì)照回路，血漿纖維蛋白原水平保持在基線水平。對(duì)于5% 重量SNAP/E2As回路，在ECC的第1小時(shí)期間血漿纖維蛋白原水平下降到基線水平的83%， 并在那個(gè)水平保持4小時(shí)ECC。血漿纖維蛋白原水平的這種下降可歸因于纖維蛋白原結(jié)合 到表面，如體外纖維蛋白原測(cè)定結(jié)果所示（見圖13)。意外的是，即使增強(qiáng)的纖維蛋白原在 SNAP/E2As涂層上吸附，這些材料仍顯示比對(duì)照小的血小板損失，表明產(chǎn)生的NO水平克服 正常促進(jìn)血小板活化的增強(qiáng)纖維蛋白原吸附。
[0050] 為了確定ECC回路的凝血室（即，在ECC回路中3/8英寸內(nèi)徑Tygon?管，8cm長(zhǎng) 度）中血栓的差別形成，在4小時(shí)血液暴露后進(jìn)行二維（2D)圖像分析。血栓面積用Image J軟件分析，表示在各凝血室中血栓形成的2D面積（像素/cm2)。對(duì)血栓面積定量，數(shù)據(jù)顯 示于圖14中。與對(duì)照比較時(shí)，對(duì)于SNAP/E2As回路，血栓面積顯著減小，雖然E2As對(duì)照也 具有相對(duì)低的血栓面積，這可能是由于E2As聚合物的增強(qiáng)的內(nèi)在生物相容性。
[0051] 新SNAP/E2As涂層的影響之一是由SNAP擴(kuò)散進(jìn)入血流引起的低血壓。同時(shí)給予 靜脈流體抵消這一影響，但在某些情況下可能造成臨床狀況困難。已報(bào)道應(yīng)用SNAP導(dǎo)致 低血壓、高血糖和削弱胰島素分泌，和減小的細(xì)胞活力。然而，在作為導(dǎo)管用于可植入小器 件的涂層時(shí)，表面積八血）體積比會(huì)很小，因此，損失到血液的SNAP的量一般不是重要問 題。另外，內(nèi)源硫醇和過氧化物歧化酶可減小很多這些不利作用。然而，臨床上已用母體硫 醇N-乙酰基-DL-青霉胺（NAP)治療汞中毒和胱氨酸尿，有輕微的副作用。雖然本文公開 的SNAP/E2AS涂層確實(shí)顯示低血壓影響，但涂層遞送的每日SNAP水平遠(yuǎn)低于導(dǎo)致上述其它 潛在不利副作用的報(bào)道水平。
[0052] 制備SNAP摻雜聚合物的潯漬方法 本公開進(jìn)一步包括用SNAP填充商業(yè)SR或PU管的方法。商業(yè)SR和PU包括醫(yī)療級(jí)管， 包括貝勾自 US plastics、Cole Palmer、Professional Plastics、ICORally 和 Thermedics， Inc的那些管。圖15顯示在SNAP/丙酮溶液中浸漬1或2天的聚氨酯（PU)管的NO釋放曲 線。然后，在Ν0Α檢驗(yàn)前，用丙酮清洗管，并干燥。為了 Ν0Α檢驗(yàn)，將管在37°C在PBS中浸 漬。
[0053] 這種浸漬方法使SNAP物類能夠結(jié)合到現(xiàn)有商業(yè)導(dǎo)管/管的壁內(nèi)。這種方法避免 在正常熱擠出條件下試圖使SNAP擠入聚合物管時(shí)由于在高溫下的N0供體（例如，SNAP和 相關(guān)物類）的熱不穩(wěn)定性可能出現(xiàn)的問題。雖然在本文所述浸漬方法中使用丙酮，但相信 可使用的其它溶劑（或溶劑的混合物）包括乙酸乙酯、環(huán)己烷、異丙醇、甲醇、丁酮等。
[0054] 用于導(dǎo)管應(yīng)用的SNAP摻雜聚合物 圖16A為根據(jù)本公開的實(shí)施例用5%重量或10%重量SNAP/E2As制備隨后涂敷E2As面 涂層的E2As導(dǎo)管的示意圖解。圖16B為圖示不同層的導(dǎo)管的橫截面圖。通常，通過浸涂 5個(gè)E2As溶液底涂層、25個(gè)相應(yīng)活性溶液涂層和5個(gè)E2As溶液面涂層制備三層導(dǎo)管。將 SNAP/E2As導(dǎo)管在暗處在37°C保持在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)中。
[0055] 圖17顯示在37°C在暗處在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)中SNAP/E2As導(dǎo)管的20天N0 釋放。圖17中的結(jié)果圖示說明在規(guī)定條件下10%重量SNAP/E2As導(dǎo)管能夠釋放NO多達(dá)20 天，5%重量SNAP/E2As導(dǎo)管能夠釋放N0多達(dá)7天。
[0056] E2As對(duì)照導(dǎo)管和10%重量SNAP/E2As導(dǎo)管在綿羊靜脈中植入7天。移出后，發(fā)現(xiàn) SNAP/E2AS導(dǎo)管具有比E2As對(duì)照導(dǎo)管顯著較少的血栓（圖18)，且減少90%細(xì)菌粘附（圖 19)。圖17至19 一起說明SNAP摻雜聚合物潛在應(yīng)用于導(dǎo)管結(jié)構(gòu)。
[0057] 為了進(jìn)一步說明本公開，在本文中給出不同的實(shí)施例。應(yīng)了解，提供這些實(shí)施例是 為了說明目的，不應(yīng)解釋為限制本公開的范圍。 實(shí)施例
[0058] 應(yīng)了解，SNAP摻雜聚合物和本文前述數(shù)據(jù)用實(shí)施例部分中所述的材料和技術(shù)產(chǎn) 生。也使用實(shí)施例部分中所述的不同檢驗(yàn)步驟。
[0059] 村料 N-乙酰基-DL-青霉胺（NAP)、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、乙二胺四乙 酸（EDTA)、四氫呋喃（THF)、硫酸和N，N-二甲基乙酰胺（DMAc)購(gòu)自Sigma-Aldrich (St. Louis, M0)。甲醇、鹽酸和硫酸購(gòu)自 Fisher Scientific(Pittsburgh, PA)。Tecophilic? SP-60D-60和Tecoflex? Sg_80A為L(zhǎng)ubrizol Advanced Materials Inc.公司（Cleveland, OH)的產(chǎn)品。Dow Corning RTV 3140 娃橡膠（SR)購(gòu)自 Ellsworth Adhesives (Germantown, WI)。Ca