用于肝再生的負載vegf的水凝膠纖維膜及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療材料技術領域，特別涉及一種用于肝再生的負載VEGF的水凝膠纖維膜及其制備方法。
【背景技術】
[0002]肝切除后余肝再生不足是影響安全肝切除的重要因素，因此提高術后余肝再生能力是一個亟待解決的問題。生長因子具有促進余肝再生的作用，目前將外源性生長因子輸送至肝臟的策略主要包括直接注射法、轉染生長因子基因至作用細胞、高分子可降解微球包裹生長因子等。但是，(1)生長因子在體內半衰期非常短，大多在數(shù)秒至數(shù)分鐘內失去活性，因此直接注射后生長因子會迅速失活；(2)采用轉染方法具有轉染效率低下和細胞毒性的缺點；(3)高分子可降解微球包裹生長因子在于生長因子容易失活，以及分子量大的生長因子在微球內不宜釋放。
[0003]VEGF(vascular endothelial growth factor，血管內皮生長因子)和HGF(hepatocyte growth factor，肝細胞生長因子)已被證明可促進肝組織再生。近期研究證實VEGF在肝竇內皮細胞(SECs)的分裂、迀移過程中扮演著重要的角色。通過結合SECs上面VEGF受體和KDR/flk-Ι)調控血管通透性。我們前期研究顯示大鼠肝切除后前24小時內肝臟內源性VEGF表達顯著降低，影響肝再生過程中早期SECs的增殖，表明VEGF在促進肝再生過程中起著重要作用。Assy等首次采用全身系統(tǒng)給予外源性VEGF促進大鼠30%肝切除后余肝再生。此后多個研究證實采用上述方法給予外源性VEGF可促血管再生進而促進肝再生。然而，采用靜脈注射給藥促進肝再生的效率低。由于肝臟血流豐富，以往采用局部給藥方式所提供的促進肝再生的藥物不易在肝臟停留，導致作用濃度不足而缺乏有效性。因而，解決有效控制肝臟局部釋放生長因子這一問題將大大提高臨床肝切除后再生的成功率，并擴大肝切除作為臨床治療手段的范圍，以挽救更多肝癌患者。因此目前亟待找到一種新的將外源性生長因子輸送至肝臟的策略方法。

【發(fā)明內容】

[0004]為克服上述現(xiàn)有生長因子給藥技術效率低、靶向性差的缺點及不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種用于肝再生的負載VEGF的水凝膠纖維膜的制備方法。本發(fā)明結合電紡絲技術的優(yōu)勢和天然可降解生物材料的特點，設計了一種新型電拉伸水凝膠纖維的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法獲得的用于肝再生的負載VEGF的水凝膠纖維膜。將包裹生長因子的纖維膜貼附于術后肝臟創(chuàng)面并控釋生長因子，具有高效促進余肝再生的性能。
[0006]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):一種用于肝再生的負載VEGF的水凝膠纖維膜的制備方法，包括以下步驟:
[0007]負載步驟:
[0008]所述的水凝膠纖維膜為海藻酸鈣水凝膠纖維膜、纖維蛋白水凝膠纖維膜、明膠水凝膠纖維膜或透明質酸水凝膠纖維膜中的一種。
[0009]所述的海藻酸鈣水凝膠纖維膜，可以通過下述制備方法獲得:將1.5-3.0被％藻酸鹽和0.1-0.6wt%聚氧乙烯的水溶液裝于注射器中，在3-5kV電壓條件下，噴射入收集池中；在循環(huán)收集池中，使用20-100mMCaCl2穩(wěn)定，通過調節(jié)電紡射流著陸的位置，在氣-液交界面可形成一張連續(xù)的水凝膠層，然后將其收集、獲得海藻酸鹽水凝膠纖維膜。
[0010]所述的纖維蛋白水凝膠纖維膜，通過下述制備方法獲得:從含有0.67wt%纖維蛋白原，1.0被％藻酸鈉和0.lwt%聚氧化乙烯的水溶液裝于注射器中，在3-5kV電壓條件下，噴射入收集池中；在循環(huán)收集池中，用含有50mMCaCld^ 5U/ml的凝血酶中交聯(lián)20分鐘，通過調節(jié)電紡射流著陸的位置，在氣-液交界面可形成一張連續(xù)的水凝膠層，然后將其收集、獲得纖維蛋白水凝膠纖維膜。
[0011]所述的明膠水凝膠纖維膜，通過下述制備方法獲得:通過3.2wt%的甲基丙烯酸酉旨膠，0.9界1:%藻酸鹽，0.lwt%聚氧化乙稀和0.4wt%紫外發(fā)光齊lj (Irgacure 2959)，于50mMCaCl2S液交聯(lián)20分鐘，然后在365nm波長的紫外光下照射10分鐘，通過調節(jié)電紡射流著陸的位置，在氣-液交界面可形成一張連續(xù)的水凝膠層，然后將其收集、獲得明膠水凝膠纖維膜。
[0012]所述的透明質酸水凝膠纖維膜，通過下述制備方法獲得:以lwt%硫醇化透明質酸，0.7*1:%藻酸鹽和0.2wt%聚氧化乙稀，在SOmMCaCljP lwt%聚乙二醇二丙稀酸酯(PEGDA)中交聯(lián)進行制備，通過調節(jié)電紡射流著陸的位置，在氣-液交界面可形成一張連續(xù)的水凝膠層，然后將其收集、獲得透明質酸水凝膠纖維膜。
[0013]上述水凝膠纖維膜凍干后，將合適濃度和體積的生長因子溶液加到凍干的水凝膠纖維膜，即每張膜規(guī)格為lcmX0.5cm，加入外源性VEGF lOOOng/張。待生長因子完全吸收后，再凍干即獲得負載生長因子的水凝膠纖維膜。該水凝膠纖維膜還可加載其他生長因子包括HGF等，劑量范圍為500-1000ng。每張膜的尺寸可以根據(jù)手術創(chuàng)面任意更改大小，通常為lcmX0.5cm-2cmX2cm，這些尺寸適用于大鼠動物實驗。臨床使用時可制備更大的尺寸。
[0014]為了調節(jié)生長因子釋放速率，在凍干的水凝膠纖維膜上可以采取溶液噴涂或浸涂方法、涂上一層可降解的聚己內酯/聚乳甘酸涂層。溶液濃度可以使用5-12.5wt%。
[0015]本發(fā)明中的用于肝再生的負載VEGF的水凝膠纖維膜的制備方法完全使用水溶劑，避免有機溶劑，因此可用此方法在水凝膠纖維中包裹生長因子，并最小程度影響其生物活性。
[0016]一種用于肝再生的負載VEGF的水凝膠纖維膜由上述制備方法獲得。
[0017]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果:
[0018]本發(fā)明結合電紡絲技術的優(yōu)勢和天然可降解生物材料的特點，設計了一種新型電拉伸水凝膠纖維的制備方法。所述的制備方法的重要特征就是利用電場和單向機械拉伸促使纖維束內部分子鏈進行取向，使得纖維內部和表面有納米取向特征，并且纖維的機械和生物性能優(yōu)越。目前已用這一方法制備出幾種天然高分子水凝膠纖維，包括海藻酸、膠原蛋白、血纖蛋白、透明質酸及其混合纖維等。這些天然高分子原材料已廣泛用于臨床，并有很好的安全使用紀錄，因此有較好的臨床轉化前景。
【附圖說明】
[0019]圖1為水凝膠纖維膜的制備及其特性；其中，a為電紡水凝膠纖維膜的示意圖，b為海藻酸鈣的水凝膠纖維；c為纖維蛋白的水凝膠纖維；d_f為水凝膠纖維表面納米取向特征，d為海藻酸鈣的水凝膠纖維表面納米取向特征，e為纖維蛋白的水凝膠纖維表面納米取向特征，f透明質酸的水凝膠纖維表面納米取向特征；g為凍干纖維束外觀；h為凍干纖維膜外觀為水凝膠纖維制成管狀結構的外觀為單根纖維重疊后在偏光顯微鏡下現(xiàn)示完全消光，證實纖維內部高度取向。
[0020]圖2為帶聚己內酯(PCL)/聚乳甘酸(PLGA)涂層的水凝膠纖維膜對生長因子釋放速率的影響結果圖。
[0021]圖3為干預組和對照組術后肝轉氨酶變化趨勢圖；其中，a為ALT變化趨勢圖；b為AST變化趨勢圖。
[0022]圖4干預組和對照組術后余肝內源性VEGF mRNA表達規(guī)律圖。
[0023]圖5干預組和對照組術后余肝內源性flt-1和KDR/flk-lmRNA表達規(guī)律圖；其中，a為內源性flt-1表達規(guī)律圖，b為KDR/f lk-lmRNA表達規(guī)律圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0025]實施例1
[0026]1.制備方法及原料:
[0027]海藻酸鈣水凝膠纖維膜:將1.5-3.0wt %藻酸鹽和0.1-0.6wt %聚氧乙烯的水溶液裝于注射器中，在3-5kV電壓條件下，噴射入收集池中；在循環(huán)收集池中，使用20-100mMCaCl2穩(wěn)定，通過調節(jié)電紡射流著陸的位置，在氣-液交界面可形成一張連續(xù)的水凝膠層，然后將其收集、制備海藻酸鹽水凝膠纖維膜；
[0028]纖維蛋白水凝膠纖維膜:從含有0.67界1:%纖維蛋白原，1.0界1:%藻酸鈉和0.lwt%聚氧化乙烯的水溶液裝于注射器中，在3-5kV電壓條件下，噴射入收集池中；在循環(huán)收集池中，用含有50mMCa