一種抗細(xì)胞凋亡Mcl-1蛋白抑制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗細(xì)胞凋亡Mcl-1蛋白抑制劑及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)和基本過程正被逐步揭示，針對(duì)其發(fā)生發(fā)展機(jī)理的分子靶向 新型抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物研究的主導(dǎo)方向。近幾年來，一些以腫瘤細(xì)胞分化凋亡 相關(guān)的關(guān)鍵蛋白作為藥物篩選靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)選擇性作用于靶位點(diǎn)的高效，低毒，特異性強(qiáng)的新 型抗癌藥物已成為當(dāng)前抗腫瘤藥物研究開發(fā)的又一新方向。
[0003]Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著非常重要的作用。該家族蛋白包含兩 類功能相反的蛋白：一類是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xl以及Bcl-w等十余 個(gè)成員；另一類是促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bad和Bim等。Mcl-1等蛋白存在著一個(gè)名 為BH3的表面結(jié)合口袋，可與許多促凋亡因子，如Bax,Bad,Bim和Bak等結(jié)合形成異二聚 體，抑制它們的促凋亡功能，造成細(xì)胞凋亡的損害[NatRevCancer，2002, 2:647-656]。研 究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Mcl-l/Bcl-2蛋白表達(dá)異常與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，幾乎所有的惡性腫瘤 細(xì)胞都高表達(dá)Mcl-l/Bcl-2蛋白，而正常組織細(xì)胞Mcl-l/Bcl-2表達(dá)水平很低[JCell Bio. 2008, 180:341-355;CancerRes, 2006, 66:9636-9645]。Mcl-l/Bcl-2 蛋白已經(jīng)是國(guó)際 上開發(fā)抗癌藥物的一個(gè)新的藥物作用靶點(diǎn)，其研發(fā)主要集中在如何抑制Mcl-l/Bcl-2蛋白 活性或降低其表達(dá)水平，來誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞的凋亡。
[0004]目前，以Bcl-2家族蛋白為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物尚無(wú)上市產(chǎn)品，有三個(gè)效果最優(yōu)的 分別處于臨床I，II，III期，分別是：由美國(guó)伊利諾州阿伯特實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的AB-737,Gemin X公司研發(fā)的GX15-070 (與Bcl-2蛋白結(jié)合的& = 0. 22μΜ)和美國(guó)Ascenta公司的 AT-101 (與Mcl-1蛋白結(jié)合的& = 0. 18μΜ)。但是它們都存在不足，如GX15-070具有不 依賴Bax/Bak的細(xì)胞毒性，正因此面臨淘汰。此外，還存在體內(nèi)的抑制活性偏低、代謝半衰 期短、連續(xù)使用易引發(fā)肝、腎毒性等諸多缺陷。因此，探索和開發(fā)安全、高效的特異性拮抗 Mcl-l/Bcl-2蛋白的藥物，特異性抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而對(duì)正常組織細(xì)胞的傷害很小，最終 實(shí)現(xiàn)安全、高效、低痛苦抗癌的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一種抗細(xì)胞凋亡Mcl-1蛋白抑制劑及其應(yīng)用。
[0006] -種抗細(xì)胞凋亡Mcl-1蛋白抑制劑及應(yīng)用，其特征在于所述的抑制劑為6, 7-二羥 基香豆素衍生物，其結(jié)構(gòu)如通式為：
[0007]
[0008] 其中，RpR2 為Η或（C「C6)烷基；
[0009] R3 為H或CH2NR5R6 ;
[0010] NR5R6為二甲胺、二乙胺、二丙胺、二異丙胺、吡咯烷、哌啶、嗎啉、哌嗪或其結(jié)構(gòu)衍生 物中的任意一種；
[0011] R4為H、（c「c6)烷基、cf3、oh-(c「c6)烷基、鹵代-(Q-Q)烷基中的任意一種。
[0012] 所述的抑制劑6, 7-二羥基香豆素衍生物的任意一種或幾種化合物均可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié) 合和拮抗Mcl-1蛋白，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)其作為抗癌化合物的應(yīng)用抑制常數(shù)&值介于 0· 2 ~15μM〇
[0013] -種抗細(xì)胞凋亡Mcl-1蛋白抑制劑的應(yīng)用，將6, 7-二羥基香豆素衍生物任意一種 或幾種化合物與化療藥物按混合后做成藥物組合物并用于癌癥的治療。
[0014] 所述6, 7-二羥基香豆素衍生物與紫杉醇做成藥物組合物并用于非小細(xì)胞肺癌的 治療，其合用的摩爾比為1:5~10:1,優(yōu)選摩爾比為1~5:1。
[0015] 本發(fā)明所涉及的新型Mcl-1蛋白抑制劑，是以植物來源的6, 7-二羥基香豆素為 基本結(jié)構(gòu)骨架，通過系列化合物的結(jié)構(gòu)-藥效、結(jié)構(gòu)-安全性、結(jié)構(gòu)-ADME屬性的多維屬性 評(píng)估及優(yōu)化，研發(fā)了上述新型Mcl-1蛋白抑制劑，該類抑制劑與Mcl-1蛋白結(jié)合的&達(dá)到 0.204μM，其抑制活性與市售Mcl-1抑制劑AT-ΙΟ?^ = 0. 18μM)的活性相當(dāng)，甚至高于 11-37(1 = 0.26μΜ)的抑制活性。此外，該類抑制劑與紫杉醇聯(lián)用可顯著增加紫杉醇對(duì) Α549細(xì)胞的抑制活性。同時(shí)，該類抑制劑還具有安全性好、易吸收以及強(qiáng)效抑制P-gp等耐 藥蛋白、可逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥等特點(diǎn)，具有良好的成藥前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1.化合物C-3對(duì)Mcl-1蛋白抑制的濃度依賴性抑制圖；
[0017] 圖2. 6, 7-二羥基衍生物結(jié)構(gòu)-Mcl-1蛋白抑制活性關(guān)系圖；
[0018] 圖3.化合物C-3與紫杉醇聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞的抑制活性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。
[0020] 主要檢測(cè)儀器及其型號(hào)：GENios多功能酶標(biāo)儀（TECAN公司，瑞士）、水平層流超凈 工作臺(tái)（上海）、HH·CP-T二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、FP-6500 熒光分光光度計(jì)（Jasco公司，日本抗體（BS1220，Bi〇W〇rld生物技術(shù)公司，美國(guó)）、 辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（34460,Qiagen生物技術(shù)公司，德國(guó)）。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 6, 7-二羥基-4-甲基香豆素（C-2)的制備
[0023]
[0024] 稱取1，2, 4-三乙酰氧基苯1.5g置于三口瓶中，加入乙酰乙酸乙酯1ml，高氯酸 5ml，室溫?cái)嚢?0分鐘后，加熱至80°C，反應(yīng)3h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液緩慢倒入冰水 30ml中，攪拌30min，過濾，收集濾餅，即為粗品。將粗品溶于20ml甲醇中，加熱至回流，lh 后冷卻至室溫，過濾，收集濾餅，真空干燥后得化合物C-21.lg，乳白色固體。
[0025] 其核磁共振檢測(cè)結(jié)果如下所示：
[0026] 4NMR(400MHz，d-DMSO)δ: 2. 31 (s，3H，CH3)，6. 09 (s，1H，C=CH)，6. 73 (s，1H，ArH )，7· 00 (s，1H，ArH)，9· 34 (s，br，1H，ArOH)，10. 19 (s，br，1H，ArOH);
[0027]13CNMR(100MHz，d-DMS0)S:18.68，103.13，109.89，110.86，111.96，143.24，148· 17, 150. 58, 153. 68, 161. 08.
[0028] 實(shí)施例2
[0029] 6, 7-二羥基-4-三氟甲基香豆素（C-3)的制備
[0030]
[0031] 稱取1，2, 4-三乙酰氧基苯1.5g置于三口瓶中，加入三氟乙酰乙酸乙酯1.4ml，高 氯酸5ml，室溫?cái)嚢?0分鐘后，加熱至80°C，反應(yīng)3h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液緩慢倒入 冰水30ml中，攪拌30min，過濾，收集濾餅，即為粗品。將粗品溶于20ml甲醇中，加熱至回 流，lh后冷卻至室溫，過濾，收集濾餅，真空干燥后得化合物C-31. 3g，淺黃色固體。其核磁 共振檢測(cè)結(jié)果如下所示：
[0032] 4NMR(400MHz，d-DMSO)δ:6· 71 (s，1H，C=CH)，6. 86 (s，1H，ArH)，7. 03 (s，1H，ArH ),9. 78 (s,br, 1H,ArOH),l〇· 61 (s,br, 1H,ArOH)；
[0033]13CNMR(100MHz，d-DMS0)δ: 104. 01，105. 05, 108. 89, 112. 12, 120. 94, 123. 68, 144 .03, 149. 59, 152. 08, 159. 62.
[0034] 實(shí)施例3
[0035] 6, 7-二羥基-4-氯甲基香豆素（C-4)的制備
[0036]
[0037] 稱取1，2, 4-三乙酰氧基苯1. 5g置于三口瓶中，加入4-氯乙酰乙酸乙酯1. 3ml，高 氯酸5ml，室溫?cái)嚢?0分鐘后，加熱至80°C，反應(yīng)3h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液緩慢倒入 冰水30ml中，攪拌30min，過濾，收集濾餅，即為粗品。將粗品溶于20ml甲醇中，加熱至回 流，lh后冷卻至室溫，過濾，收集濾餅，真空干燥后得化合物C-31. 2g，乳白色固體。
[0038] 其核磁共振檢測(cè)結(jié)果如下所示：
[0039] 4NMR(400MHz，d-DMSO)δ: 4. 90 (s，2H，CH2C1)，6. 40 (s，1H，C=CH)，6. 78 (s，1H，A rH), 7. 12 (s, 1H,ArH), 9. 48 (s,br, 1H,ArOH), 10. 39 (s,br, 1H,ArOH).
[0040] 實(shí)施例4
[0041] 6, 7-二羥基-4-羥甲基香豆素（C-5)的制備
[0042]
[0043] 稱取6, 7-二羥基-4-氯甲基香豆素500mg置于單口瓶中，加入N,N-二甲基甲酰 胺1. 0ml，水5ml，加熱至回流，反應(yīng)20h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束，冷卻后有固體析出，過濾，收集 濾餅，即為粗品。將粗品溶于2ml甲醇中，加熱至回流，0. 5h后冷卻至室溫，過濾，收集濾餅， 真空干燥后得化合物C-5200mg，淺褐色固體。
[0044] 其核磁共振檢測(cè)結(jié)果如下所示：
[0045]4NMR(400MHz，d-DMSO)δ:4· 63 (s，2H，CH20H)，6. 21 (s，1H，C=CH)，6. 75 (s，1H，A rH), 6. 94 (s, 1H,ArH), 9. 31 (s,br, 1H,ArOH), 10. 19 (s,br, 1H,ArOH).
[0046] 實(shí)施例5
[0047] 6, 7-二甲氧基香豆素（C-9)的制備
[0048]
[0049] 稱取6, 7-二羥基香豆素1. 0g置于三口瓶中，加入N，N-二甲基甲酰胺5. 0ml，碳 酸鉀2.lg，碘甲烷1. 2ml，25°C反應(yīng)8h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束，加入水40ml猝滅反應(yīng)，乙酸乙酯 30mlx3提取，合并乙酸乙酯相，水洗30mlx2,無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，將溶劑減壓蒸干，殘留 物硅膠柱層析分離，得化合物C-90. 95g，淺黃色固體。
[0050] 其核磁共振檢測(cè)結(jié)果如下所示：
[0051]4 匪R(400MHz，d-DMS0)δ:3. 80 (s，3H，CH30)，3. 86 (s，3H，CH30)，6. 29 (d，J= 8. OHz, 1H,COCH= 0,7. 06 (s, 1H,ArH), 7. 25 (s, 1H,ArH), 7. 95 (d,J= 8.OHz, 1H,C=CH).
[0052] 13CNMR(100MHz,d-DMSO)δ：56. 34, 56. 63, 100. 50, 109. 38, 111. 64, 113. 11, 144. 7 9, 146. 31, 149. 88, 152. 99, 161. 01.
[0053] 實(shí)施例6
[0054] 6, 7-二羥基-8-(亞甲基二甲胺基）香豆素（C-10)的制備
[0055]
[0056] 稱取6, 7-二羥基香豆素0· 9g溶于40ml甲醇中，加入37%甲醛水溶液L0ml，30% 二甲胺水溶液〇. 8ml，加熱至35°C反應(yīng)8h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束，將溶劑減壓蒸干，殘留物硅膠 柱層析分離（洗脫劑為二氯甲烷：甲醇=10:1~3:1)，得化合物C-10180mg，棕黃色固體。
[0057] 其核磁共振檢測(cè)結(jié)果如下所示：
[0058] 4NMR(400MHz，d-DMS0)δ: 2. 49 (s，6H，2CH3)，4. 03 (s，2H，CH2)，6. 03 (d，J= 8. 0Hz ,1H,ArH),6. 86 (s, 1H,ArH),7. 79 (d,J= 12. 0Hz, 1H,ArH),8. 16 (s, 1H,ArOH).
[0059] 實(shí)施例7
[0060] 6, 7-二羥基-8-(1-亞甲基吡咯烷基）香豆素（C-ll)的制備
[0061]
[0063] 稱取6, 7-二羥基香豆素L8g溶于90ml甲醇中，加入37%甲醛水溶液L6ml，吡 咯烷0. 9ml，加熱至65°C反應(yīng)8h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束，將溶劑減壓蒸干，殘