培養(yǎng)液，加入含有10%DMS0胎牛血清lmL，用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞均勻后，吸入到無 菌凍存管中。先放入4°C冰箱中30min后，再放入液氮瓶口位置2h，最后放入液氮瓶中進(jìn)行 凍存。
[0042] 實(shí)施例4 :泥螺寡肽抗肺癌H1299細(xì)胞活性試驗(yàn)
[0043] (4. 1)對H1299細(xì)胞增殖抑制的影響
[0044] 取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200μL，設(shè)5個平行孔，于 5%C02,37°C貼壁16-48h，倒置顯微鏡下觀察，棄去培養(yǎng)液，同時(shí)將泥螺酶解液以不同濃度 分別溶于培養(yǎng)液中。然后分別加入每個孔，同時(shí)設(shè)不加樣品的對照組，置5%C02,37°C培養(yǎng) 箱中孵育36h，用PBS沖洗2遍，加入含有MTT的營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去 孔內(nèi)培養(yǎng)液。加入二甲基亞楓，置搖床上低速振蕩lOmin，采用酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm測 吸光度值（0D值）。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制指數(shù)（IR，Inhibitionrate)，即增殖抑制率，按下列 公式計(jì)算：
[0045]
[0046] 將實(shí)施例1中制得的泥螺寡肽設(shè)置為5個濃度組，分別為6mg/mL、8mg/mL、10mg/ mL、12mg/mL和14mg/mL。作用24、36小時(shí)后，對H1299細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行MTT檢測。結(jié) 果表明：作用36h后，泥螺寡肽對H1299細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到74. 3%，如表1所示，并且， 對H1299細(xì)胞增殖抑制率與泥螺寡肽的濃度以及作用時(shí)間分別正相關(guān)，如圖3、圖4所示。
[0047] 表1泥螺寡肽對H1299細(xì)胞的增殖抑制率（X士s)(η= 3)
[0048]
[0049] 注：*與每個組分的最小的細(xì)胞抑制率相比，P〈0. 05
[0050] (4. 2)對H1299細(xì)胞凋亡的影響
[0051] (4. 2.1)HE染色
[0052] 蓋玻片經(jīng)過多聚賴氨酸酸化24h,自來水沖洗20遍，蒸饋水浸泡24h,干燥后高壓 滅菌等方法處理，小心的平鋪在六孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)瓶中的癌細(xì)胞〇. 25%的消化液進(jìn)行 消化，待細(xì)胞間隙明顯且變圓變亮?xí)r，吸掉消化液，營養(yǎng)液加入10%胎牛血清，用滴管反復(fù) 吹打至單個細(xì)胞，用培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)為1X1〇5·mL1左右。小心的接種到蓋玻片上，每 孔滴加2mL左右，然后放入到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待蓋玻片上的細(xì)胞長滿80%左右，加入用 營養(yǎng)液配好的不同濃度藥物組和對照組進(jìn)行培養(yǎng)。
[0053] 細(xì)胞爬片結(jié)束后，小心的將蓋玻片取出，輕輕的用PBS洗2次，每次lmin左右，然 后95%酒精固定15111；[11，輕輕的用？135洗3次，每次3111；[11。加入蘇木素染色8111；[11，自來水浸 洗30s，鹽酸酒精分化，自來水浸洗。當(dāng)細(xì)胞核變藍(lán)時(shí)，再加入伊紅染液復(fù)染30s，自來水浸 洗。分別用50%、75%、95%和無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，每次5min，共3次。用中性 樹脂將染好色的玻片進(jìn)行封片，有細(xì)胞的一面一定要向下貼合在載玻片上。在光學(xué)顯微鏡 下觀察形態(tài)并攝片。
[0054] 如圖5所示，對照組肺癌H1299細(xì)胞可以觀察到細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，大小均勻，核染色 質(zhì)均勻細(xì)膩，細(xì)胞核大小較一致。泥螺寡肽對H1299細(xì)胞作用24h后，B圖為6mg/mL濃度 下形態(tài)，特征有細(xì)胞外形改變，細(xì)胞膜變得不規(guī)則，細(xì)胞核染色較濃，細(xì)胞質(zhì)輕度集中現(xiàn)象。 C圖為10mg/mL藥物濃度下的細(xì)胞，出現(xiàn)較為明顯的細(xì)胞核固縮，出現(xiàn)空泡，細(xì)胞膜較B圖進(jìn) 一步變得不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)染色呈凝塊狀，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的小體現(xiàn)狀；D圖為14mg/mL藥物濃 度下的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特點(diǎn)，出現(xiàn)細(xì)胞不規(guī)則、胞膜脫落等特征。
[0055] (4· 2· 2)A0/EB熒光染色
[0056] 取對數(shù)生長期的肺癌H1299腫瘤細(xì)胞，加入適量胰酶進(jìn)行消化，用含10%的胎牛 血清培養(yǎng)液配成懸液，把蓋玻片平鋪到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，向每孔加入細(xì)胞懸液2mL，將細(xì) 胞板放在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿玻片的80%左右后取出。將藥液分 別加入各孔中，再將細(xì)胞板放到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板。取出載玻片， 加1滴混合熒光染色液：1〇〇μg/mL吖啶橙（A0)、100μg/mL嗅乙啶（EB)混勻，滴在載玻片 上，將爬滿細(xì)胞的蓋玻片壓上，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。
[0057] 熒光染色法是根據(jù)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜完整性不同，使吖啶橙（A0)和溴乙啶 (EB)混合染料染成不同顏色，來區(qū)別細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。圖6所示，A是正常的H1299細(xì)胞 在熒光顯微鏡下無明顯凋亡細(xì)胞，細(xì)胞大小、分布都很均勻。B圖是藥物濃度為6mg/mL作用 24h后，早期凋亡細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)較為完整，核染色質(zhì)著綠色，但核已開始固縮，C圖表現(xiàn)為細(xì) 胞核為A0染色呈黃綠色熒光，濃聚成顆粒狀，位于細(xì)胞的一側(cè)，早期凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì) 胞核為A0染色呈黃綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞也增多；D圖為高劑量組（14mg/mL)核染色質(zhì) 發(fā)橙紅色熒光，呈固縮狀。
[0058] (4. 2. 3)FCM分析細(xì)胞凋亡
[0059] 將培養(yǎng)好的H1299細(xì)胞用0. 25 %胰酶/0. 02 %EDTA混合液進(jìn)行消化，消化好的細(xì) 胞用PBS清洗1-2次，胰酶消化時(shí)間不要過長，以免引起假陽性。把消化好的細(xì)胞吸入離 心管中，在4-6°C下離心（1200r/min) 5min，吸去上清液，加入400ul的結(jié)合液，輕輕的反復(fù) 吹打使細(xì)胞成為單個細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1X106cells/mL左右，在細(xì)胞懸浮液中加入5ul的 FITC染色液混勻，在4-6°C下進(jìn)行避光孵育15min，然后加入10ul的PI染液，輕輕混勻在 4-6°C下孵育5min，將處理完的細(xì)胞立即放入FACS進(jìn)行檢測。
[0060] 流式細(xì)胞術(shù)（FCM)可以將樣品中正常、壞死和凋亡細(xì)胞等分開。如圖7所示，A-1、 A-2、A-3、A-4各圖譜中細(xì)胞分為四個區(qū)：左上象限代表的是機(jī)械損傷細(xì)胞；左下象限代表 的是正常細(xì)胞；右上象限為晚期凋亡或壞死的細(xì)胞；右下象限代表的是早期凋亡細(xì)胞?？?見隨著多肽濃度的增加，H1299細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡也在逐漸增大，當(dāng)泥螺寡肽濃度 為14mg/mL時(shí)，早凋?yàn)?9. 74%，晚凋?yàn)?6. 43%。
[0061] 以上各實(shí)施例中使用的主要儀器和材料如下：
[0062] 主要儀器
[0063] 超凈臺ZHJM-C12090,上海智城分析儀器制造有限公司；
[0064] Forma3111細(xì)胞培養(yǎng)箱，杭州寶城生物科技有限公司；
[0065] 酶標(biāo)儀（美國BI0-RAD);杭州寶城生物科技有限公司；
[0066] FACS Calbur流式細(xì)胞儀，BD公司；
[0067]OLYMPUSCKX41倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS公司；
[0068] 伯樂680酶標(biāo)儀（美國），杭州寶城生物科技有限公司；
[0069]OLYMPUS顯微鏡 500 萬像素Pro-MicroScanCCD，日本OLYMPUS公司；
[0070] 試劑
[0071] 牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；
[0072]MTT(美國SIGMA公司）；
[0073]F12粉末培養(yǎng)基（美國SIGMA公司）；
[0074]RPMI1640 培養(yǎng)基，Gibco公司；
[0075]DMS0;(美國SIGMA公司）
[0076] Α0/ΕΒ染色料，昊天生物技術(shù)有限公司
[0077]AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒；貝博生物公司
[0078] 青霉素、鏈霉素；魯抗醫(yī)藥股份有限公司
[0079] 細(xì)胞株
[0080] 人肺癌細(xì)胞H-1299購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞庫。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種泥螺寡肽在抗肺癌H1299細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的泥螺寡肽在抗肺癌H1299細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所 述泥螺寡肽的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所述。3. 如權(quán)利要求2所述的泥螺寡肽在抗肺癌H1299細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述 泥螺寡肽通過以下步驟制得：新鮮泥螺洗凈去殼，取泥螺組織搗碎，加入蒸餾水勻漿，料液 比為1: (3~4)，用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液將勻漿液的pH值調(diào)節(jié)為8~9,加入0. 4~ 0. 5 %勻漿液體積的胰蛋白酶，40~50°C保溫水解7~9h，水解完成后95~KKTC、10~ 15min進(jìn)行滅酶，4°C下水解液于9500~10000r/min離心15~20min，取上清液，經(jīng)3kd超 濾膜超濾獲得分子量小于3kd的第一組分，將該第一組分經(jīng)凝膠層析洗脫獲得第二組分， 最后將該第二組分經(jīng)反相高效液相色譜分離獲得所述泥螺寡肽。4. 如權(quán)利要求3所述的泥螺寡肽在抗肺癌H1299細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所 述凝膠層析條件如下：所述第一組分的濃度為48~50mg/mL、上樣量為3~4mL、速度為 2. 5~3. 5ml/min，流動相為超純水，280nm紫外檢測。5. 如權(quán)利要求3所述的泥螺寡肽在抗肺癌H1299細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，其特征在于： 所述反相高效液相條件如下：選用ZorbaxSB-C18(4. 6X250,5um);柱溫為20°C;流動 相為1%TFA和乙腈；梯度洗脫：從開始到30min結(jié)束，乙腈濃度從0變化到40%，洗脫速度 為1. 0~1. 5mL/min;進(jìn)樣體積為50ul，紫外檢測波長分別為214nm、280nm。6.如權(quán)利要求1~5中任一權(quán)利要求所述的泥螺寡肽在抗肺癌H1299細(xì)胞藥物中的應(yīng) 用，其特征在于：6~14mg/ml所述泥螺寡肽作用于H1299細(xì)胞24~36h后，對肺癌H1299 細(xì)胞的增殖抑制率為21. 3~74. 3%，且增殖抑制率與泥螺寡肽的濃度呈正相關(guān)。7. 如權(quán)利要求1~5中任一權(quán)利要求所述的泥螺寡肽在抗肺癌H1299細(xì)胞藥物中的應(yīng) 用，其特征在于：6~14mg/ml所述泥螺寡肽作用于H1299細(xì)胞24h后，對肺癌H1299細(xì)胞 的早期凋亡和晚期凋亡的影響率分別為15~19. 74%和33~36. 43%，且增殖抑制率與泥 螺寡肽的濃度呈正相關(guān)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種泥螺寡肽在抗肺癌中的應(yīng)用，尤其涉及該泥螺寡肽在抗肺癌H1299腫瘤細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。該泥螺寡肽的氨基酸序列為Gln-Pro-Pro-Gly-Leu，以泥螺為原料，通過胰蛋白酶酶解泥螺組織，結(jié)合凝膠層析和高效液相色譜分離純化獲得。本發(fā)明中的泥螺寡糖可對肺癌H1299腫瘤細(xì)胞顯著抑制，其中對H1299細(xì)胞的增殖抑制率可達(dá)21.3～74.3％，對肺癌H1299細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡的影響率分別為15～19.74％和33～36.43％，可見具有顯著地抗腫瘤活性。泥螺寡肽具有良好的開發(fā)前景，對泥螺寡糖的抗肺癌H1299腫瘤細(xì)胞的研究可為抗肺癌藥物的開發(fā)研究提供理論支持。
【IPC分類】A61K38/08, A61P35/00
【公開號】CN105311617
【申請?zhí)枴緾N201410279283
【發(fā)明人】馬劍茵, 李云濤, 卜天
【申請人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2014年6月20日