一次~幾個月一次。例如，在作為緩釋制劑（長 效制劑）給藥時，或者在通過緩釋栗（例如滲透栗）進行局部（例如鞘內(nèi)）持續(xù)給藥時，給 藥間隔可以為幾周~幾個月一次。這種持續(xù)給藥的優(yōu)點在于，因為HGF蛋白質長期逐漸地 釋放到脊髓損傷或脫髓鞘疾病的部位，所以HGF長期發(fā)揮作用，能夠得到更好的治療效果。 進一步的優(yōu)點在于，由于給藥次數(shù)少，減輕對患者的負擔。更進一步的優(yōu)點在于，根據(jù)需要， 可以將HGF蛋白質追加給予到皮下植入的滲透栗。如上所述，作為給藥方法優(yōu)選為局部給 藥，但是也可以為諸如肌內(nèi)給藥、皮下給藥或點滴注射等其它給藥方法。給藥時間可根據(jù)劑 型、疾病的程度、患者年齡等因素適當?shù)剡x擇。例如，脊髓損傷的情況下，優(yōu)選在剛損傷后14 天內(nèi)，更優(yōu)選在7天內(nèi)，最優(yōu)選在4天內(nèi)進行給藥。特別是對于脊髓損傷患者，考慮到患者 的狀態(tài)在受傷后72小時內(nèi)難以穩(wěn)定，特別優(yōu)選在剛損傷后約72小時~4天內(nèi)給藥。上述 給藥時間包括持續(xù)給藥時的給藥開始時，或重復給藥時的初次給藥時。
[0075] 實施例
[0076] 以下使用實施例對本發(fā)明進行說明，但是本發(fā)明不被這些實施例所限定。在以下 的實施例中使用的HGF蛋白質為5個氨基酸缺失型重組HGF蛋白質（序列號2)。
[0077] [實施例1]
[0078] (脊髓損傷動物的制備和HGF蛋白質的給藥）
[0079] (1)脊髓損傷動物的制備
[0080] 首先，無菌準備滲透栗（OsmoticPump)。將HGF蛋白質（濃度：lmg/mL，溶解在PBS 中）或PBS(對照）注入到Alzet小型滲透栗（miniosmoticpump)(ALZACorporation制， Model2002)中。將用HGF蛋白質或PBS充滿內(nèi)腔的內(nèi)徑為0.3mm、外徑為0.7mm的硅膠管 (株式會社4vA7制，導管）與栗排出部連接，用另一內(nèi)徑為1. 〇mm、外徑為2. 0mm的硅膠 管（株式會社4VΛ7制）覆蓋連接部，接著在37°C下培養(yǎng)栗和管部件12小時，然后用于 實驗。
[0081 ] 通過14w/v%的水合氯醛的腹腔內(nèi)給藥，將成年雌性斯普拉格-道利 (Sprague-DaWley、SD)大鼠（周齡約10~12周，體重約250g)麻醉，將第十胸椎和第十二 胸椎椎板切除。然后將滲透栗（用上述方法預先填充有HGF蛋白質溶液）植入到右背側皮 下，導管從皮下區(qū)域通過肌肉層。之后，導管的頂端到達第十二胸椎椎弓。然后，用IH沖擊 器（PrecisionSystems制）在第十胸部脊髓節(jié)段制造200k達因（kDyne)的擠壓傷。之后， 在頭尾向的軸的方向上使第十二胸部脊髓的硬膜和蛛網(wǎng)膜一起裂開，由此將導管插入到蛛 網(wǎng)膜下腔且導管的頂端到達損傷脊髓點。使用外科用粘接劑7 口 > 7少7 7A"三共"（三 共株式會社制）將導管固定在肌肉層的內(nèi)側和外側。粘接劑充分干燥后，分別縫合肌肉層 和皮膚，完成手術。
[0082] ⑵HGF蛋白質的給藥
[0083] 手術后（擠壓傷后），通過上述滲透栗將HGF蛋白質溶液鞘內(nèi)給藥2周（HGF蛋白 質的給藥量，200μg/2周）。對照組僅給予PBS。
[0084] [實施例2]
[0085] (組織分析和結果）
[0086] 在固定的手術后期間后，通過14w/v%水合氯醛的腹腔內(nèi)給藥對大鼠進行深度麻 醉，接著，依次用PBS、用4w/v%的多聚甲醛/PBS從心臟的左心室進行灌注。取出脊髓斷片， 隨后在4°C下固定在4w/v%的多聚甲醛/PBS中24小時。將組織樣品在4°C下先后浸漬在 lOw/v%的蔗糖/PBS溶液和30w/v%的蔗糖/PBS溶液各24小時，之后植入到0CT復合物 (寸夕7 7/4 >亍夕二力；14土）中。立即在液氮中冷凍植入的組織，制備20μm的冷凍 切片。然后，用蘇木精和曙紅（HE)對組織切片進行染色，進行組織檢查。其結果如圖1所 示，與對照組相比，在HGF蛋白質組中，由于運動神經(jīng)的退化和細胞死亡引起的的腔形成得 到顯著抑制，由此表明，擠壓引起的脊髓退化得到抑制。
[0087][實施例3]
[0088](髓鞘染色和結果）
[0089] 用95v/v%乙醇處理通過實施例2記載的方法制備的切片，之后，在60°C下，于勒 克司堅牢藍（LuxorFastBlue、LFB)溶液中培養(yǎng)2小時。從培養(yǎng)器取出后，放置切片直至 冷卻至室溫，用95v/v%乙醇和蒸餾水進行洗滌。然后，重復進行用碳酸鋰溶液和70v/v% 乙醇進行的分餾以及用蒸餾水進行的洗滌，直至得到適當?shù)膶φ?，之后，將切片脫水、密封?并觀察髓鞘。如圖2所示，與對照組相比，在HGF蛋白質組中的LFB-陽性髓鞘表面積大，表 明由于脊髓損傷引起的脫髓鞘得到抑制。
[0090][實施例4]
[0091](免疫組織化學分析和結果）
[0092] 用多克隆5HT抗體（1:100稀釋）和多克隆抗-GAP43抗體（1:1000稀釋）對通過 實施例2記載的方法制備的切片進行染色。即，在室溫下用含有5v/v%山羊血清和0.lw/ v%曲通（Triton)X-100的PBS封閉1小時后，在4°C下，于上述抗體溶液中培養(yǎng)切片一整 夜。用PBS洗滌這些切片，然后在室溫下，于用Alexa488 (綠）和Alexa546 (紅（1:1000 稀釋））進行熒光標記的二次抗體內(nèi)培養(yǎng)1小時，密封到載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察5HT 陽性神經(jīng)纖維和GAP43陽性神經(jīng)纖維。其結果如圖3所示發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在HGF蛋白 質組中，5HT陽性神經(jīng)纖維在距離損傷部位4mm尾側顯著多。而且，如圖4所示，在5HT陽性 信號與GAP43陽性信號的局部具有良好的一致性。5HT陽性神經(jīng)纖維負責脊髓損傷后的運 動機能以及GAP43在成體中僅在再生神經(jīng)纖維中表達，表明通過HGF蛋白質的給藥使與運 動機能相關的神經(jīng)纖維的再生得到促進。
[0093][實施例5]
[0094](運動機能評價和結果）
[0095] 通過曠場試驗觀察通過實施例1記載的方法剛產(chǎn)生脊髓損傷后，開始用HGF 蛋白質（200yg/2周）治療動物的運動機能。由多個觀察者目視觀察動物的行為，用 BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評分系統(tǒng)進行評價，其中以0 (完全癱瘓）~21 (正常）的 21等級評價運動機能。手術后6周評價后肢運動機能。結果如圖5所示。
[0096] 由圖5明顯可知，在HGF蛋白質組中，脊髓損傷4天后開始觀察到機能恢復，與5 周后觀察到的對照組相比，具有顯著的機能恢復效果（P< 0. 05)。
[0097][實施例6]
[0098] 以與實施例1同樣的方法制備脊髓損傷動物，隨后進行充滿有HGF蛋白質（2mg/ mL，溶解于PBS中）或PBS(對照）的滲透栗的植入和導管的插入。手術后（擠壓傷后），通 過滲透栗將HGF蛋白質溶液鞘內(nèi)給藥4周（HGF蛋白質的給藥量，400yg/4周）。對照組僅 給予PBS。直至手術后9周通過實施例5所述的方法進行運動機能評價。其結果如圖6所 不。
[0099] 由圖6明顯可知，與對照動物相比，用HGF蛋白質治療的動物的機能恢復明顯得到 改善。自脊髓損傷4天后明顯不同。而且，甚至在HGF蛋白質給藥結束后，BBB評分還持續(xù) 升尚。
[0100] [實施例7]
[0101] 通過14w/v%的水合氯醛的腹腔內(nèi)給藥，將成年雌性斯普拉格-道利 (Sprague-Dawley、SD)大鼠（周齡約10~12周，體重約250g)麻醉，用IH沖擊器 (PrecisionSystems制）在第十胸部脊髓節(jié)段制造200k達因的擠壓傷，由此提供脊髓損傷 動物。為了植入滲透栗，在擠壓傷后4天、2周或8周對脊髓損傷動物進行再手術。通過與 實施例1相同的方法皮下植入充滿有HGF蛋白質（2mg/mL，溶解于PBS中）或PBS(對照） 的滲透栗，將導管插入到蛛網(wǎng)膜下腔，然后導管的頂端到達受損脊髓點，最終固定導管。在 擠壓傷后4天、2周或8周開始，通過滲透栗將HGF蛋白質溶液鞘內(nèi)給藥4周（HGF蛋白質的 給藥量，400μg/4周）。對照組僅給予PBS。通過與實施例5相同的方法隨時間變化對運動 機能進行評價。其結果如圖7、圖8和圖所示。
[0102] 由圖7明顯可知，在擠壓傷后4天開始進行HGF治療的動物組中，觀察到機能恢復 比對照組動物快。
[0103] 由圖8明顯可知，與對照組相比，在擠壓傷后2周開始進行HGF治療的動物組中， 觀察到在開始HGF治療2周后（擠壓傷4周后）機能恢復的促進效果。
[0104] 由圖9明顯可知，在擠壓傷后8周開始進行HGF治療的動物組中，觀察到給予HGF 蛋白質的動物與對照動物之間的機能恢復沒有差異。
[0105] [制劑實施例1]
[0106] 將乳酸-乙醇酸共聚物（乳酸/乙醇酸=50/50,重均分子量=10, 000,和光純藥 工業(yè)株式會社制）1. 9g溶解在3.OmL的二氯甲烷中。接著，向該有機溶劑溶液中添加HGF 蛋白質冷凍干燥粉末l〇〇mg，使用混合磨（株式會社u7爹I)精細研磨，由此制備HGF蛋 白質分散液。將該分散液添加到0.lw/v%的聚乙烯醇水溶液800mL中，然后使用均相混 合機進行攪拌、均質化。在室溫下攪拌3小時使二氯甲烷蒸發(fā)，之后，通過離心