/ml) 攪拌均勻后，115°C滅菌30min后，取2份（ml)，加入步驟（2)配制的無菌海藻酸鈣溶液20 份（ml)，混合均勻后，加入步驟（1)準(zhǔn)備好的BHK21細胞種子液22份（ml)，使BHK21細胞 的終濃度為〇. 5X106cell/ml，攪拌均勻后作為水相；
[0096] (4)油相混合液的配制：按照1:1000的體積比將0. 1份Span80加入100份液體 石蠟中作為油相；
[0097] (5)沉降劑的配制：配制濃度為0· 2mol/L的CaCl2溶液，115°C滅菌30min，2~8°C 保存?zhèn)溆茫?br>[0098] (6)微膠囊的制備：在NBSCelligen310生物反應(yīng)器中，在400rpm的攪拌速度下， 按照水相與油相體積比為1:5的比例，向油相中緩慢加入水相，然后按照冰醋酸與油相的 體積比為1:500的比例，按照0. 5ml/min的流速加入冰醋酸，加入冰醋酸后攪拌lOmin，停止 攪拌，再按照沉降劑與水相體積比為1:10的比例，按照5ml/min的流速加入沉降劑，待膠 囊沉淀后，依次除去水相和油相，得包裹BHK21細胞的微膠囊。
[0099](7)微膠囊的洗滌：用滅菌PBS洗滌微膠囊2次，用含體積百分比濃度為1%血清 的MEM洗滌1次后，即可用于包被后培養(yǎng)；
[0100] (8)微膠囊大規(guī)模培養(yǎng)：將含有微囊化BHK21細胞的Celligen310細胞培養(yǎng)系統(tǒng) 中，添加無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其中生物反應(yīng)器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧、攪拌速度 等參數(shù)，適用于微載體懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器；
[0101] (9)微膠囊接毒：微囊化細胞培養(yǎng)48h后，取微囊消化后計數(shù)，按照MOI= 0. 1接 入鴨坦布蘇病毒，設(shè)定培養(yǎng)溫度37°C，pH7. 4,溶氧50、攪拌速度60rpm，進行反應(yīng)器自動控 制培養(yǎng)，接毒后每隔一定時間取細胞微載體觀察細胞病變情況，待細胞病變達80%病變時 (病毒含量達到最高，病毒含量在l(f°TCID5(]/ml)停止反應(yīng)器攪拌，待微囊全部沉到反應(yīng)器 底部后，收獲上清液；
[0102] (10)病毒液的收獲：培養(yǎng)的上清液經(jīng)過濾、橫向切留超濾處理去除細胞碎片及部 分雜蛋白，即制得病毒液。然后加入0.02%滅活劑BEI滅活37°C滅活72h，然后37°C加入 10%V/V(0.頂）硫代硫酸鈉終止BEI活性，然后將滅活后的病毒液于-20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br>[0103] (11)鴨坦布蘇病毒抗原滅活檢驗：滅活后，無菌從每瓶病毒滅活液中取樣，接種 96孔板，同步介入貼壁的BHK21細胞，培養(yǎng)120h后，無細胞病變。
[0104] 實施例6、利用生物反應(yīng)器微囊化純懸浮PK15細胞在生物反應(yīng)器連續(xù)放大
[0105] (1)在NBSCellgenll53L生物反應(yīng)器中，按照實施方案一制備生物微膠囊包被 PK15細胞，每天取樣，消化后計算細胞濃度，當(dāng)細胞密度達到10X106cell/ml時停止攪拌。
[0106] (2)靜止后待微囊沉淀后，用蠕動泵抽出上清培養(yǎng)液，并用pH為7. 4無Ca2+， Mg2+PBS洗滌2遍，加入含質(zhì)量體積比為0. 25 %胰酶和質(zhì)量體積比為0. 02 %的EDTA. 2Na消 化液，攪拌lOmin后微囊自動溶解，細胞自動解離，解離后計數(shù)并調(diào)整細胞密度使PK15細 胞密度為2X106cell/ml，細胞活率在95%以上。
[0107] (3)在NBSCellgen31010L或NBSCellgen51040L的生物反應(yīng)器中，按照實施方案 一相同生物微膠囊制備方法，包被步驟2制備的細胞，并在10L或40L進行大規(guī)模培養(yǎng)，從 而實現(xiàn)3L到10L或3L到40L生物反應(yīng)器的線性放大，培養(yǎng)至細胞密度達到10X106cell/ ml時可繼續(xù)放大，按照步驟（2)的方法進行微囊的溶解和細胞的消化，消化后可用于進一 步放大。
[0108] (4)在更大規(guī)模的100L或500L生物反應(yīng)器中，按照實施方案一相同生物微膠囊制 備方法，包被步驟3制備的細胞，并在100L或500L進行大規(guī)模培養(yǎng)，從而實現(xiàn)10L到100L 或4L到500L生物反應(yīng)器的線性放大。
[0109] 放大后的微囊化細胞可用于病毒的培養(yǎng)、或細胞產(chǎn)物的制備生產(chǎn)。
[0110] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)制備疫苗方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 利用微囊化方法制備微囊化動物細胞； (2) 在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，接入所述微囊化動物細胞進行培養(yǎng)； (3) 在所述細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中接入病毒進行培養(yǎng)，收獲病毒液，制備疫苗。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中微囊化方法包括物理化學(xué) 法，物理機械法，化學(xué)法；所述物理化學(xué)法包括單凝聚法，復(fù)凝聚法，溶劑-非溶劑法，改變 溫度法，液中干燥法；所述物理機械法包括噴霧干燥法，噴霧凝結(jié)法，空氣懸浮法；所述化 學(xué)法包括界面縮聚法和輻射交聯(lián)法。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)微囊的囊材包括明膠，阿拉伯 膠，海藻酸鹽，殼聚糖，蛋白類囊材，羧甲基纖維素鈉，醋酸纖維素酞酸酯，乙基纖維素，甲基 纖維素，聚酰胺，硅橡膠，聚丙烯酸樹脂，聚乙烯醇，聚碳酯，聚氨基酸，聚乳酸，丙交酯乙交 酯共聚物。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述動物細胞包括：CHO細胞、BHK21細胞、 Marcl45細胞、Vero細胞、F81細胞、豬腎傳代細胞系PK-15或IBRS-2或其它敏感豬源細 胞、ST細胞、牛睪丸細胞、牛羊犬的腎細胞、雞胚成纖維細胞、昆蟲卵巢細胞、白紋伊蚊細胞 Aa2-678、小菜蛾細胞BCIRL-Px2-HNU3、草地貪葉蛾卵巢細胞Sf21及其克隆株Sf9和粉紋夜 蛾胚胎細胞BTI-Tn5-BI-4,以及所述各種細胞的亞型細胞株及其馴化、基因工程改造型細 胞株。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中細胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括各種細胞 培養(yǎng)瓶、袋系統(tǒng)、一次性塑料袋系統(tǒng)、生物反應(yīng)器在內(nèi)的各種形式和基于各種原理的細胞培 養(yǎng)系統(tǒng)或裝置；其中，所述生物反應(yīng)器包括攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、細胞懸 浮或貼壁式生長生物反應(yīng)器、間歇式或流加式或連續(xù)灌注式生物反應(yīng)器、wave生物反應(yīng)器 在內(nèi)的細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)中所述病毒包括豬瘟病毒、豬 繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、豬 偽狂犬病毒、豬偽狂犬病毒、鴨坦布蘇病毒、禽流感病毒、雞法氏囊病毒、雞傳染性支氣管炎 病毒、雞減蛋綜合癥病毒、乙腦病毒、狂犬病毒、口蹄疫病毒、犬瘟熱病毒和重組桿狀病毒。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)結(jié)束后使用胰酶消化溶解微 囊，并重復(fù)所述步驟（1)的細胞包被過程，所述重復(fù)包被過程重復(fù)多次。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)中所述接入病毒進行培養(yǎng)的過 程為流加培養(yǎng)。9. 如權(quán)利要求1~8任一項所述方法在制備疫苗方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)制備疫苗方法，該方法包括以下步驟：(1)利用微囊化方法制備微囊化動物細胞；(2)在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，接入該微囊化動物細胞進行培養(yǎng)；(3)在該細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中接入病毒進行培養(yǎng)，收獲病毒液，制備疫苗。采用微囊化技術(shù)進行動物細胞的培養(yǎng)，解決了細胞大規(guī)模連續(xù)放大的問題，還發(fā)現(xiàn)利用該培養(yǎng)的動物細胞來繁殖病毒，病毒含量較高，用此病毒液來制備病毒疫苗同樣起到比較好的免疫效果。本發(fā)明還提供了一種哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)制備細胞表達產(chǎn)物的方法。本發(fā)明降低了對微載體的依賴，生產(chǎn)成本有較大的降低。
【IPC分類】C12N7/00, A61P31/20, A61K39/295, A61P31/14
【公開號】CN105311630
【申請?zhí)枴緾N201410280110
【發(fā)明人】張許科, 孫進忠, 王進產(chǎn), 田克恭
【申請人】普萊柯生物工程股份有限公司
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2014年6月20日