四肽SEQIDNO1至7處理顯著誘導(dǎo)正常人類表皮角質(zhì)細(xì)胞至刮傷區(qū)域中的迀移，如通 過7小時處理后受傷區(qū)域的閉合的百分比所指示。
[0025] 血管生成（即從已存在血管網(wǎng)絡(luò)形成新的毛細(xì)血管）是傷口修復(fù)的基本步驟。本 發(fā)明中所生成的肽SEQIDNO1至7也刺激毛細(xì)血管形成。體外血管生成分析使用人類臍 靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)測量一系列導(dǎo)致形成新的毛細(xì)血管的事件。在誘導(dǎo)時，HUVEC進(jìn)行迀 移以對準(zhǔn)，然后從個別細(xì)胞發(fā)芽。發(fā)芽事件導(dǎo)致形成新的毛細(xì)血管，其進(jìn)一步發(fā)育以形成閉 合多邊形。最終，發(fā)育成復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。人類組織蛋白酶抑制素（cathelicidin)肽LL-37 是經(jīng)充分研究的促進(jìn)血管生成的實(shí)例。其在評估中用作陽性對照。新的毛細(xì)血管的發(fā)芽僅 在使用LL-37處理3小時后即變得可視（表2)。在利用LL-37處理5小時后，形成閉合多 邊形。與LL-37相比，SEQIDN0. 1、2、3、4、5、6和7誘導(dǎo)HUVEC的類似變化，從而在3小時 和5小時處理下導(dǎo)致新的毛細(xì)血管形成和復(fù)雜多邊形結(jié)構(gòu)（表2)。相比之下，隨機(jī)生成的 肽SEQIDNO8(KMG)和PBS在觀測到LL-37和本發(fā)明肽的血管生成活性時不誘導(dǎo)這種變 化（表2)。
[0026] 眾所周知革蘭氏陽性細(xì)胞壁組分肽聚糖（PGN)刺激促炎性細(xì)胞因子表達(dá)。脂磷壁 酸（LTA)是引起包括氧化氮合成酶（iNOS)、環(huán)氧合酶-2(C0X-2)、IL-Ιβ、TNF-α和IL-6 上調(diào)的促炎性信號的濃度-和時間-依賴性增加的PGN中的關(guān)鍵分子（Lin等人，2010)。 因此我們使用本發(fā)明肽預(yù)處理LTA并且然后評估在與人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞接觸時的IL-6刺 激活性。如表3中所顯示，使用SEQIDN0 1、2、3、4、5、6和7預(yù)處理LTA顯著降低人類皮 膚角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中的LTA刺激的IL-6表達(dá)的量，這表明所述肽可中和游離LTA的毒性效 應(yīng)。極為可能的是，四肽的帶正電荷的殘基結(jié)合至帶負(fù)電荷的LTA，從而阻斷LTA與其受體 的相互作用。這是顯著的，這是因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞壁組分已參與炎癥性皮膚病，諸如痤瘡、酒糟 鼻、異位性皮膚炎等。
[0027] 細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)是傷口修復(fù)中的另一重要步驟。我們測試本發(fā)明肽對人類皮膚角 質(zhì)細(xì)胞的增殖活性。與刮傷測試、血管生成和阻斷LTA誘導(dǎo)的IL-6表達(dá)中所測量的趨化性 活性相比，本發(fā)明肽對角質(zhì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)顯示多樣但中等的活性。SEQIDNO1(HB2233) 顯示對角質(zhì)細(xì)胞增殖的抑制性活性，針對SEQIDNO3 (HB2270)也觀測到這種抑制性活性。 SEQIDN0 6似乎刺激角質(zhì)細(xì)胞增殖，但這種活性僅為有限。對角質(zhì)細(xì)胞增殖的抑制性活性 提示我們測試TGF-β1表達(dá)，這是因?yàn)楸娝苤松L因子抑制細(xì)胞增殖。如表4中所顯 示，SEQIDNO1和3二者在培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)中等的TGF-β1表達(dá)水平。
[0028] 由MatTek公司（AshlandMA)研發(fā)的S0R-300-FT是包括正常的人源性角質(zhì)細(xì)胞 和牛皮癬性纖維母細(xì)胞的高度分化的體外牛皮癬組織。在形態(tài)上，所述組織具有一致厚度 并且其表達(dá)增加的過度增殖細(xì)胞水平以及促炎性標(biāo)記（諸如牛皮癬素（psoriasin)、彈性 蛋白酶抑制劑（elafin)、人類β-防御素-2(beta-defensin_2)和LL-37 等）（Ayehunie 等人，2012)。組織的促炎性條件提示我們測試本發(fā)明肽以檢查其是否調(diào)節(jié)炎癥性反應(yīng)。由 于所述組織模型的成本較高，選擇代表性肽SEQIDNO1HB2233作為使用S0R-300-FT組織 模型的概念研究的證據(jù)。使用HB2233以200μg/ml-式兩份處理S0R-300-FT組織。研究 總共12種與牛皮癬病狀相關(guān)的基因標(biāo)記。研究是同時采用卡泊三醇（calcipotriol)平行 運(yùn)行。qPCR分析顯示，在處理72小時后，SEQIDN01(HB2233)使在發(fā)炎的牛皮癬皮膚中 過度表達(dá)的LL-37的表達(dá)水平顯著下調(diào)（3. 7倍）（表5)。牛皮癬藥物卡泊三醇顯著下調(diào) HBD-2(9.0倍）和牛皮癬素（2. 3倍）。HB2233和卡泊三醇下調(diào)負(fù)責(zé)牛皮癬皮膚中的角質(zhì) 細(xì)胞的過度增殖和早熟的Ki67表達(dá)。另外，SEQIDNO1(HB2233)也下調(diào)CXCLl(GROa) 和CXCL5 (ENA-78)表達(dá)，與正常健康皮膚相比，此二者的表達(dá)在牛皮癬皮膚中均顯著上調(diào) (AyehunieS.，2012)，然而，卡泊三醇似乎不影響兩種基因的水平。此明顯表示HB2233可 為經(jīng)由與目前用于治療炎癥性皮膚?。ㄖT如牛皮癬）的藥物卡泊三醇不同的機(jī)制產(chǎn)生作用 的新穎治療劑。
[0029] 為更好地理解相同肽影響正常健康皮膚組織的方式，我們將SEQIDNO: 1HB2233 置于基因譜分析研究中，所述研究是由SunnyBiodiscovery(SantaPaula,CA)實(shí)施，使用 自MatTek公司（Ashland,ΜΑ)購得的EPIDERM?正常人類皮膚替代物。在以一式兩份使用 肽或水對照物處理24小時之前，先使皮膚替代物平衡過夜。在處理結(jié)束后，萃取RNA并且使 其經(jīng)受PCR陣列分析。如表6中所顯示，SEQIDN01HB2233刺激參與ECM合成的基因（膠 原和整合素）。如人們所預(yù)期，它調(diào)節(jié)趨化因子（CXCL11和MAPK3等）和生長因子（TGF-β1 和VEGF等）?；蜃V分析研究支持體外觀測到的本發(fā)明肽調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、血管生成和傷口 愈合活性的活性。
[0030] 使用標(biāo)準(zhǔn)Fm0C(9-芴基甲氧基羰基）固相化學(xué)合成本發(fā)明中所包括的所有肽。所 述肽可使用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸制備為酰胺化或游離酸序列形式。羧基末端的酰胺化可使得本發(fā)明 肽對蛋白酶降解較不敏感并與游離酸形式相比增加其溶解度，從而提供升高的治療效能。 所述肽可包含L-或D-氨基酸對映異構(gòu)體，包含一種對映異構(gòu)體形式或兩種形式的組合的 殘基。所述肽可在N末端和C末端兩者上修飾。例如，據(jù)討論N末端脂化或乙酰化可改善 跨越皮膚的肽滲透而不會改變肽的生物活性功能（Samah，2011)。因此，肽也可被脂化，這可 提供增強(qiáng)的皮膚滲透?？捎糜谔峁┍景l(fā)明化合物的C12-18脂質(zhì)組分的飽和或不飽和脂肪 酸的示例包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、油酸和亞麻油酸。 肽的羧基末端可使用酸（-COOH)或酰胺化（例如，-C0NH2、-CONHR或-C0NR2)修飾。羧基 末端的酰胺化可使得本發(fā)明肽對蛋白酶降解較不敏感并與游離酸形式相比增加其極性，從 而提供升高的治療效能。此外，通常可被修飾的肽官能團(tuán)包括羥基、胺基、胍鹽、羧基、酰胺、 酚、咪唑環(huán)或巰基。
[0031] 肽也可偶聯(lián)至可溶性或不可溶性載體分子以根據(jù)需要修飾其溶解度特性并且 增加靶向組織中的肽的局部濃度?？扇苄暂d體分子的實(shí)例包括（但不限于）聚乙二醇 (PEG)與聚乙烯吡咯啶酮的聚合物；不可溶性聚合物的實(shí)例包括（但不限于）硅酸鹽、聚 苯乙烯和纖維素。肽可使用脂質(zhì)體技術(shù)或經(jīng)由奈米技術(shù)被微囊化以增強(qiáng)其穩(wěn)定性并用于 控制釋放。對于以上方案，肽一般可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的任何方法諸如以下 文獻(xiàn)中所公開的方法產(chǎn)生：Merrifield(JAmChemSoc. 85:2149, 1963);Carpino等人（J OrgChem. 51:3732, 1986);Merrifield等人（AnalChem. 38:1905, 1966);或Kent等人 [HighYieldChemicalSynthesisOfBiologicallyActivePeptidesOnAnAutomated PeptideSynthesizerOfNovelDesign,IN:PEPTIDES1984(Ragnarsson編輯）Almqvist andWiksell公司，Stockholm(Sweden)，第185頁至第188頁]，所述全部文獻(xiàn)均以引用方 式全文并入本文中。
[0032] 本發(fā)明涉及使用上文所描述的肽（諸如）用于在制劑中或作為治療劑的方法。這 些方法可涉及使用單一肽或多個肽的組合。在某些情況下，本發(fā)明組合物可放置于置于皮 膚的上、其中或其下方的裝置內(nèi)。此種裝置包括以通過被動或主動釋放機(jī)制接觸皮膚或毛 囊的方式釋放所述物質(zhì)的透皮貼劑、植入物和注射劑。在本文中所描述方法的用于遞送肽 的組合物可呈氣溶膠、乳液、液體、洗劑、溶液、凝膠、微囊體、乳膏、糊劑、油膏、粉劑、泡沫劑 或其他藥學(xué)上可接受的制劑的形式。此外，肽可使用較少涉及的制劑（諸如去離子/蒸餾 水、PBS或標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)用鹽水溶液）遞送。
[0033] 所述制劑選擇性地具有化妝品吸引力和/或包含其他試劑諸如類視色素、維生素 C或可用作用于本發(fā)明肽的治療作用的佐劑的其他肽。也可將抗生素添加至制劑中以避免 感染，從而容許發(fā)生最大愈合進(jìn)程。
[0034] 所述制劑可包含蛋白酶抑制劑。可選擇蛋白酶抑制劑以特異性靶向預(yù)期將降解所 選擇生物活性肽的蛋白酶；此選擇將基于生物活性肽的長度和/或序列來決定。然而，蛋 白酶抑制劑未必需要以任何具體方式選擇；例如，在本發(fā)明中可采用包含兩種或更多種抑 制劑的蛋白酶抑制劑混合物（cocktail)。可將以下類型的蛋白酶抑制劑納入本發(fā)明中：絲 氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、 硫醇蛋白酶抑制劑和蘇氨酸蛋白酶抑制劑。本發(fā)明中所用的蛋白酶抑制劑可為肽或蛋白 質(zhì)或化學(xué)物。此種抑制劑的非限制性實(shí)例為絲氨酸蛋白酶抑制劑（抗胰蛋白酶），其包括 α-1-抗胰蛋白酶、補(bǔ)體1-抑制劑、抗凝血酶、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、血纖維蛋白溶酶原活 化劑抑制劑1和神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑（neuroserpin);或可用作用于本發(fā)明肽的治療 作用的佐劑的化學(xué)物，包括但不限于熊果酸和氨甲環(huán)酸（tranexamicacid)。
[0035] 通常，藥學(xué)上可接受的制劑將包括適于在人類皮膚上使用的任何載體。此種藥學(xué) 上和美容上可接受的載體包括乙醇、二甲亞砜、甘油、二氧化硅、氧化鋁、淀粉和等效載體以 及稀釋劑。所述制劑任選地具有化妝品吸引力和/或含有其他試劑，諸如類視色素或可用 作用于本發(fā)明肽的治療作用的佐劑的其他肽。也可將抗生素添加至制劑中以避免感染，從 而容許發(fā)生最大愈合進(jìn)程。組合物中的肽的濃度可為約0. 1μg/mL至約500μg/mL或約 0. 1yg/mL至約10% ;然而，所采用的極限濃度可在這些范圍外有所不同，這取決于傷口 / 組織情況的性質(zhì)、本發(fā)明肽的生物活性和使用任何佐劑或技術(shù)以獲得增強(qiáng)的組合物吸收。 CTFACosmeticIngredientHandbook第二版（1992)描述多種在皮膚護(hù)理行業(yè)中常用的 非限制性化妝品和藥物成分，其適宜用于本發(fā)明的組合物中。這些成分類別的示例包括： 研磨劑、吸收劑、美容組分（諸如香味劑、顏料、著色劑（coloring/colorant)、精油、皮膚感 知劑、收斂劑等（例如，丁香油、薄荷腦、樟腦、桉樹油、丁香酚、乳酸甲酯、金縷梅精））、抗痤 瘡劑、抗結(jié)塊劑、消泡劑、抗微生物劑（例如，丁基氨基甲酸碘丙酯）、抗氧化劑、粘合劑、生 物添加劑、緩沖劑、增量劑、螯合劑、化學(xué)添加劑、化妝品殺生物劑、變性劑、藥物收斂劑、外 用止痛劑、成膜劑或材料、遮光劑、pH調(diào)整劑、推進(jìn)劑、還原劑、螯合劑、皮膚漂白劑和美白劑 (例如，氫醌、曲酸、抗壞血酸、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡萄糖胺）、皮膚調(diào)理劑（例如，保 濕劑）、皮膚安撫劑和/或愈合劑（例如，泛醇及其衍生物、蘆薈、泛酸及其衍生物、尿囊素、 沒藥醇和甘草酸二鉀）、皮膚治療劑、增稠劑和維生素及其衍生物。
[0036] 可向人類和動物（包括所有哺乳動物）進(jìn)行本發(fā)明肽和相關(guān)組合物的施用。也可 與典型和/或?qū)嶒?yàn)材料（諸如組織移植物、皮膚替代物、組織培養(yǎng)產(chǎn)物和敷料）的組合施 加。示例包括但不限于紗布（織造和非織造、經(jīng)浸漬、不黏連、填塞、清創(chuàng)）；壓迫繃帶和系 統(tǒng)；傷口填充物和清潔劑；接觸層；膠原；羊膜；非細(xì)胞人類真皮；非細(xì)胞基質(zhì)和組合產(chǎn)品； 和多種常用敷料。
[0037] 常用敷料的列表
[0038]
[0039] 通常，組合物可局部、經(jīng)口、經(jīng)皮、全身性或通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的可用 于向目標(biāo)組織遞送本發(fā)明肽的任何其他方法施用。例如，組合物也可以體外或離體方式