絲素蛋白雙層仿骨膜材料的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及仿骨膜材料的制備方法，具體涉及絲素蛋白雙層仿骨膜材料的制備方法。本方法屬于生物材料領域，所制備的材料可廣泛用于骨組織修復。
【背景技術】
[0002]人工骨修復材料植入體內后，充分的營養(yǎng)輸送對于材料的降解以及組織再生、血管化都至關重要。有研究表明組織液在三維人工骨支架材料中的滲透厚度在0.5cm左右，但支架材料的厚度往往大于這個值，因此大塊的支架材料不利于組織液滲透以及細胞向支架深層長入。自體骨的主要優(yōu)點在于其表面有一層骨膜，其中豐富的微血管能讓骨頭重新恢復血供，從而在移植部位快速促進骨愈合，因此自體骨修復成功率高。骨膜有內外兩層結構，外層主要由膠原纖維緊密結合而成，富有血管網，使骨骼具有活性，并參與骨膜的成骨活動，是成骨關鍵所在；內層由較粗的膠原纖維、成骨細胞、內皮細胞、干細胞構成，對骨的生長(長長，長粗)和增生(斷裂愈合)有重要作用。由此可見，骨膜作為重要界面，能增加骨與周圍組織間的融合、利于成骨細胞生長、為骨組織供血等作用，而骨膜的缺失正是自體骨難以自愈合以及異體骨或人工骨材料修復骨缺損失敗的重要原因。Hoffman MD等通過使用可降解PEG水凝膠制備的組織工程骨膜用于異體移植骨表面，發(fā)現(xiàn)與直接使用異體移植相比，血管化程度增加了 2.4倍，軟骨內骨化程度增加了 2.8倍，生物力學強度增加了 1.8倍(Hoffman, M.D., et al.(2013).〃The effect of mesenchymal stem cells deliveredvia hydrogel-based tissue engineered per1steum on bone allograft healing.〃B1materials 34(35): 8887-8898.) 0 Frohbergh，Μ.E.等通過靜電紡絲的方法構建了殼聚糖-羥基磷灰石復合膜，該膜為不能承重的骨材料提供了一個仿骨膜的環(huán)境，有利于成骨細胞的生長、增殖和分化，并顯示出了很好的骨誘導性(Frohbergh, Μ.Ε.，et al.(2012).〃Electrospun hydroxyapatite-containing chitosan nanofibers crosslinkedwith genipin for bone tissue engineering.B1materials 33(36): 9167-9178.)。而我國蘭州大學的趙琳等也嘗試用SIS (小腸黏膜下層)作為人工骨膜用于CSD的修復，結果表明復合BMSCs (骨髓間充質干細胞)后對1.5cm長的骨缺損具有明顯的修復作用，在12周時可見成熟的骨髓腔形成(Zhao, L., et al.(2011)."Comparative study betweentissue-engineered per1steum and structural allograft in rabbit critical-sizedradial defect model.〃 Journal of B1medical Materials Research Part B: AppliedB1materials 97B(1): 1-9.) 0這些研究成果證實了采用仿骨膜材料修復骨缺損的可行性，為骨組織修復提供了新思路。
[0003]通常組織結構較為復雜，很多組織如血管、皮膚都具有多層結構，這些復雜結構為組織提供了特定的生物環(huán)境，為了利用組織工程原理更好的仿生設計組織修復材料，則需要盡可能模擬組織特定的幾何結構。模擬組織結構的組織工程支架的構建以及關鍵因子的慘入(Liu, X., et al.(2014)."Delivery of Growth Factors Using a Smart PorousNanocomposite Scaffold to Repair a Mandibular Bone Defect.〃 B1macromolecules15(3): 1019-1030.)對于組織修復的成功更為有利。然而，當前報道的仿骨膜材料還僅限于單層結構材料的研究，且較少與其他活性物質復合，尚沒有很好的模擬骨膜結構與功能。

【發(fā)明內容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種絲素蛋白雙層仿骨膜材料的制備方法。
[0005]為實現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn):
一種絲素蛋白雙層仿骨膜材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:
(1)外層紡絲液的制備:血管內皮生長因子(VEGF)活化后，加入到純絲素水溶液中，60°C下攪拌濃縮得到絲素(SF)/VEGF紡絲液；
(2)內層紡絲液的制備:在水溶液體系中以絲素為模板，采用共沉淀法合成羥基磷灰石(SF/HA)納米粒，然后將SF/HA納米粒加入到SF水溶液中，60 °C下攪拌濃縮得到HA/SF紡絲液；
(3)雙層仿骨膜材料的制備:接收裝置接地后，控制接收距離為10-20厘米，注射器內裝入內層紡絲液，加正高壓，調節(jié)液體流速，得到厚度為0.01-0.1毫米的纖維膜，然后更換注射器內紡絲液為外層紡絲液，加正高壓，調節(jié)液體流速，得到總厚度為0.05-0.2毫米的雙層纖維膜；
(4)所得到的雙層纖維膜浸泡于濃度為70-100%的甲醇/水溶液中進行后處理，得到不溶于水的雙層仿骨膜材料。
[0006]所述VEGF / SF 質量比為 2ng/mg-20ng/mg。
[0007]所述HA/SF 質量比為 0.01mg/mg-0.lmg/mg。
[0008]所述外層紡絲液質量濃度為35%_40%。
[0009]所述內層紡絲液質量濃度為30% -36%ο
[0010]所述正高壓為10_30kV。
[0011]所述外層液體流速為0.1-lmL/h。
[0012]所述內層液體流速為0.1-0.5 mL/h。
[0013]本發(fā)明目的在于模擬骨膜的雙層結構特點，提供雙層仿骨膜材料的制備方法，所制備的雙層仿骨膜材料可用于骨修復，包裹骨缺損部位。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)勢在于:(1)內外層基材相同，層與層之間相容較好；(2)內層與外層分別模擬骨膜的結構進行設計，具有雙層結構，外層為絲素負載生長因子，內層為絲素復合羥基磷灰石，分別起到促血管生成和促骨生長能力；(3)雙層膜采用靜電紡絲技術制備而成，能更好模擬骨膜的微納米纖維網絡結構。
【附圖說明】
[0015]附圖1為雙層仿骨膜材料設計示意圖。
【具體實施方式】
[0016]以下通過具體的實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步描述。以下的實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不限制本發(fā)明的范圍。
[0017]實施例1: (1)外層紡絲液的制備:VEGF(血管內皮生長因子)活化后，VEGF / SF質量比為2ng/mg加入到純絲素水溶液中，60°C下攪拌濃縮得到濃度為38%的SF (絲素)/VEGF紡絲液；
(2)內層紡絲液的制備:向濃度為0.1%的絲素蛋白水溶液中，加入0.lmol/L的磷酸氫二銨水溶液，然后緩慢加入0.lmol/L硝酸鈣溶液，并調節(jié)pH=10左右，控制鈣磷摩爾比為1.67，控制絲素與羥基磷灰石質量比為0.2，反應兩小時后，將溶液離心分離得到沉淀，然后用乙醇反復離心洗滌，冷凍干燥得到SF/HA (羥基磷灰石)納米粒，然后將SF/HA納米粒加入到SF水溶液中，60 °C下攪拌濃縮得到濃度為35%的HA/SF紡絲液；
(3)雙層仿骨膜材料的制備:接收裝置接地后，控制接收距離為15厘米，注射器內裝入內層紡絲液，加正15kV高壓，調節(jié)液體流速為lmL/h，得到厚度為0.1毫米的纖維膜，然后更換注射器內紡絲液為外層紡絲液，加正20kV高壓，調節(jié)液體流速為0.2 mL/h,得到總厚度為0.02毫米的雙層纖維膜；
(4)所得到的雙層纖維膜浸泡于濃度為90%的甲醇/水溶液中進行后處理，得到不溶于水的雙層仿骨膜材料。
[0018]實施例2:
(1)外層紡絲液的制備:VEGF(血管