粘膜粘附性聚γ谷氨酸納米膠束及利用其的藥物載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和親脂性化合物的復(fù)合物形成的納米膠束，更詳細(xì)而言，涉及一種由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和親脂性化合物的復(fù)合物形成的納米膠束及其制備方法和利用上述納米膠束的粘膜粘附特性的藥物載體。
【背景技術(shù)】
[0002]本發(fā)明涉及能夠利用作為生物相容性天然高分子的聚γ谷氨酸來傳遞藥物或熒光體的聚γ谷氨酸納米膠束及其制備方法。藥劑的給藥途徑中最常用的途徑為口服給藥，但在直接施用于粘膜部位而能夠提高治療效果的藥品以及通過粘膜吸收對(duì)于提高生物體利用率的提高有效的藥物的情況下，粘膜作為主要的替代給藥途徑而受到矚目。粘膜以胃腸道等不露出在外部的部位為代表，存在于口腔、鼻腔、生殖器、直腸、消化器、皮膚潰瘍部位等。向這些粘膜部位給藥的生理活性物質(zhì)與通常口服給藥而被吸收的藥物相比，具有能夠被直接吸收到血流中從而藥物表達(dá)所需要的時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。另外，在對(duì)于口腔、鼻腔、呼吸器官粘膜、眼粘膜、生殖器粘膜、皮膚潰瘍部位來說，與口服給藥相比，對(duì)病灶部位直接給藥具有能夠更好地提高藥效的優(yōu)點(diǎn)。
[0003]另外，由于粘膜周圍集中了許多免疫細(xì)胞，因此將流行性感冒疫苗用抗原物質(zhì)通過粘膜來進(jìn)行傳遞，從而增強(qiáng)粘膜免疫性也是非常重要的。此時(shí)，如果被用作抗原載體的材質(zhì)除了能夠單純地執(zhí)行抗原的傳遞性的作用以外，還能夠執(zhí)行有助于免疫細(xì)胞的活化的疫苗佐劑物質(zhì)的功能，則能夠稱其價(jià)值非常大。
[0004]作為粘膜粘附性高分子，一直以來較多地使用聚丙烯酸材質(zhì)的物質(zhì)。美國注冊專利第4，292，299號(hào)中提出了利用聚丙烯酸及其衍生物與聚丙烯酸纖維素衍生物等的共聚物的粘膜粘附性藥物體，在歐洲注冊專利第654，261號(hào)中，為了獲得粘膜粘附性而使用了纖維素醚衍生物、聚丙烯酸衍生物和明膠的物理性混合組合物。另外，美國注冊專利第5，942，243號(hào)中，將聚苯乙烯作為基礎(chǔ)成分的共聚物用作粘膜給藥用藥物傳遞制劑成分。但是，這些粘膜粘附性材質(zhì)中的大部分是通過化學(xué)合成方法制備的有機(jī)合成物質(zhì)。因此，基于具有生物體親和性的來自生物體材質(zhì)的粘膜粘附性載體的開發(fā)活躍地開展著。
[0005]作為用于形成粘膜的主要成分的粘蛋白是從動(dòng)物的外分泌腺分泌的粘性物質(zhì)的統(tǒng)稱，指與糖類結(jié)合的復(fù)合蛋白質(zhì)。該粘蛋白促進(jìn)作為細(xì)胞的主要成分的蛋白質(zhì)的消化，從而在體內(nèi)起到有用的作用，并起到胃壁保護(hù)作用、解毒作用。該粘蛋白存在的器官為口腔、鼻腔、喉、胃腸道、眼睛、肛門、陰道，其厚度從數(shù)nm?170 μπι不等。粘蛋白網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)通過各種鍵來維持，其鍵有離子鍵、氫鍵、二硫鍵、范德華鍵、粘蛋白之間的交聯(lián)等。對(duì)與這樣的鍵連接的粘膜附著性高分子的研究活躍地開展著，主要以具有與存在于粘蛋白層的鍵相互作用較強(qiáng)的特征的高分子為主。已知，通常粘膜層具有復(fù)雜的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在數(shù)微米的大小的細(xì)菌的情況下，通常不能通過粘膜層，但在粘膜層崩塌的地方或薄處，一部分能夠通過。在10納米左右大小的抗體和比其大的質(zhì)粒DNA的情況下，雖然能夠通過粘膜層，但被存在于粘膜層的許多酶而分解，因此難以通過粘膜層。已知在200納米以下大小的病毒的情況下，快速地通過粘膜層。
[0006]關(guān)于本發(fā)明中使用的聚γ谷氨酸，其作為具有羧基的多肽，申請了關(guān)于利用生產(chǎn)高分子量的聚γ谷氨酸的耐鹽性菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)清國醬菌株(Chung kook jang)來生產(chǎn)聚γ谷氨酸的方法的專利(韓國注冊專利第500796號(hào))和含有聚γ谷氨酸的抗癌組合物、免疫強(qiáng)化劑、免疫調(diào)節(jié)劑、病毒感染抑制的專利(韓國注冊專利第496606號(hào)，第517114號(hào)，第475406號(hào)，第0873179號(hào))。另外，對(duì)物質(zhì)的醫(yī)藥用途的研究在持續(xù)進(jìn)行，持續(xù)地查明了多種功效。
[0007]對(duì)此，本發(fā)明人為了開發(fā)具有粘膜粘附特性的藥物載體，進(jìn)行例示的努力，結(jié)果確認(rèn)了由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和親脂性化合物的復(fù)合物形成的納米膠束具有粘膜粘附特性和免疫強(qiáng)化效果以及將上述納米膠束用作藥物載體時(shí)向粘膜的藥物傳遞效果高，從而完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于，基于作為來自生物體的天然高分子的聚γ谷氨酸，從而提供粘膜粘附性優(yōu)異的納米膠束及其制備方法。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于，提供利用粘膜粘附性優(yōu)異的納米膠束的藥物載體。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和親脂性化合物的復(fù)合物形成的納米膠束。
[0011]本發(fā)明還提供一種由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和親脂性化合物的復(fù)合物形成的納米膠束的制備方法，其包括以下步驟:(a)在聚谷氨酸溶液中混合親脂性化合物-胺復(fù)合物溶液來制備聚谷氨酸-親脂性化合物復(fù)合物的步驟；以及(b)用胺系化合物處理上述聚谷氨酸-親脂性化合物復(fù)合物，從而用氨基取代聚γ谷氨酸的羧基，由此制備由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和親脂性化合物的復(fù)合物形成的納米膠束的步驟。
[0012]本發(fā)明還提供一種納米膠束藥物載體，其特征在于，在由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和親脂性化合物的復(fù)合物形成的納米膠束的內(nèi)部封入有選自由蛋白質(zhì)、基因、肽、化合物、抗原和天然物質(zhì)組成的組中的藥物。
【附圖說明】
[0013]圖1是示出根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的粘膜粘附性聚γ谷氨酸-膽固醇納米膠束(T -PGA nanomicelles)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式以及該納米膠束所具有的病毒抗原載體的特性的原理概念圖(a)，并且將該納米膠束的粒徑用DLS (b)和Cryo-TEM(C)顯示。
[0014]圖2示出小鼠模型中將注入到鼻腔內(nèi)的粘膜粘附性聚γ谷氨酸-膽固醇納米膠束的粘膜粘附性利用(a)SPECT/CT和(b)免疫組織熒光成像法(b)測定的影像。
[0015]圖3是示出小鼠模型中將導(dǎo)入有模型抗原(OVA)的聚γ谷氨酸-膽固醇納米膠束注入鼻腔內(nèi)之后測定抗原特異性免疫功效的結(jié)果。(a)OVA-特異性IgG抗體反應(yīng)的誘導(dǎo)能力測定(為了對(duì)比，比較示出了聚Y谷氨酸中只取代有如膽固醇那樣的親脂性基團(tuán)的聚Y谷氨酸-膽固醇(γ-PGA-Cholesterol，表面為羧基)復(fù)合物的情況下出現(xiàn)的抗原特異性免疫反應(yīng))，(b) OVA-特異性IgA抗體反應(yīng)的誘導(dǎo)能力測定，(c)示出對(duì)生成通過IFN-γ ELISpot驗(yàn)證的IFN-γ的細(xì)胞的個(gè)數(shù)進(jìn)行測定的結(jié)果。(**，ρ〈0.01 ;***，ρ〈0.001，n.s.，不顯著(not significant))。
[0016]圖4是示出小鼠模型中將導(dǎo)入有流行性感冒病毒抗原的聚γ谷氨酸-膽固醇納米膠束注入鼻腔內(nèi)之后測定抗原特異性免疫功效的結(jié)果(1.PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水)，2.僅PR8，3.PR8+聚γ谷氨酸-膽固醇納米膠束(10 μ g)，4.PR8+聚γ谷氨酸-膽固醇納米膠束(100 μ g)。(a)流行性感冒病毒特異性IgG抗體的生成測定，(b)流行性感冒病毒特異性IgA抗體的生成測定，(c)對(duì)生成通過IFN-γ ELISpot驗(yàn)證的IFN-γ的細(xì)胞的個(gè)數(shù)進(jìn)行測定，(d)利用病毒抗體測定血凝素的血液凝集反應(yīng)抑制功效，(e)施用疫苗后病毒感染的小鼠體重的變化，(f)示出對(duì)施用疫苗后病毒感染的小鼠的致死率的測定。(*，p〈0.05;**，ρ〈0.01 ;***，ρ〈0.001.n.s.，不顯著)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]從一個(gè)方面出發(fā)，本發(fā)明涉及由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和親脂性化合物的復(fù)合物形成的納米膠束及其制備方法。
[0018]本發(fā)明的由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和親脂性化合物的復(fù)合物形成的納米膠束通過以下步驟制備:
[0019](a)將聚谷氨酸溶液和親脂性化合物-胺復(fù)合物溶液混合來制備聚谷氨酸-親脂性化合物復(fù)合物的步驟；以及
[0020](b)將上述聚谷氨酸-親脂性化合物復(fù)合物用胺系化合物處理，用氨基取代聚γ谷氨酸的羧基，從而制備由一部分羧基被氨基取代的聚γ谷氨酸和親脂性化合物的復(fù)合物形成的納米膠束的步驟。
[0021]本發(fā)明中，親脂性化合物可以使用選自由膽固醇及其衍生物、具有碳數(shù)3?21個(gè)的脂肪族化合物(C3-C21)以及包含I?10個(gè)苯基的芳香族化合物組成的組中的化合物。
[0022]作為一個(gè)例子，親脂性化合物中膽固醇系的特征在于，選自膽固醇(Cholesterol)、膽固醇 β -D-葡糖苷(Cholesterol β -D-glucoside)、膽留醇基N-(三甲基錢乙基)氨基甲酸酯氯化物(Cholesteryl N-(trimethyl ammon1ethyl)carbamate chloride)、膽留醇油醇碳酸酯(Cholesteryl oleyl carbonate)、膽留燒醇(Cholestanol)、羊毛甾醇(Lanosterol)、安妥明(Clofibrate)、膽甾醇油酸酯(Cholesteryl oleate)、美伐他汀(Mevastatin)、疏基膽固醇(Th1cholesterol)、豆留燒醇(Stigmastanol)、膽留醇棕櫚酸酯(Cholesteryl palmitate)、二乙基傘形酮磷酸酯(Diethylumbelliferylphosphate)、膽固醇十七燒酸酯(Cholesteryl heptadecanoate)、
谷甾醇(β-Sitosterol)、5 α -膽甾燒(5 a-Cholestane)、5-膽甾稀 _3_ 酮(5-Cholesten-3-one)等膽固醇及其化合物和衍生物。
[0023]親脂性化合物中生育酚系的特征在于，其選自(±)_α -生育酚((±) - a -Tocopherol)、(+) - δ -生育酸((+) - δ -Tocopherol)、DL- α -生育酸醋酸酯(DL- a -Tocopherol acetate)、(+) - y -生育酸((+)_ y -Tocopherol)、維生素 E 醋酸酯(Vitamin E acetate)、短葉松素(Pinobanksin)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate)、視黃醇乙酸酯(Retinyl acetate)等由10?100余個(gè)的碳形成的生育酸及前體、衍生物化合物。
[0024]親脂性化合物中脂肪族(aliphatic)化合物可以選自包括丙炔(Propyne)、丙稀醛(Acrolein)、丙稀醇(Allyl alcohol)、稀丙硫醇(2-Propene-l_th1