治療炎癥性疾病的方法和非免疫原性組合物的制作方法
【專利說(shuō)明】治療炎癥性疾病的方法和非免疫原性組合物
【背景技術(shù)】
[0001] 本技術(shù)涉及治療炎癥性疾病的方法，包括骨關(guān)節(jié)炎。特別地，方法特定包括使用含 細(xì)胞因子的溶液，包括源自血液和其它組織的非免疫原性溶液。
[0002] 炎癥是復(fù)雜的細(xì)胞和生化過(guò)程，在受影響的血管和鄰近組織中出現(xiàn)，響應(yīng)損傷或 者物理、化學(xué)或生物學(xué)劑如病原體、過(guò)敏原或刺激物所導(dǎo)致的異常刺激而出現(xiàn)。所述炎癥過(guò) 程包括局部反應(yīng)和導(dǎo)致組織內(nèi)形態(tài)變化；破化或移除致病物；引起修復(fù)和治愈的反應(yīng)。大 部分情況下，炎癥是有益和暫態(tài)過(guò)程，其隨著機(jī)體攻擊和克服傳染劑或其它有害試劑而減 少。然而，一些情況下，炎癥可以是慢性自保持過(guò)程，例如作為持續(xù)退化過(guò)程（如關(guān)節(jié)炎）或 自身免疫疾病的一部分，導(dǎo)致組織損壞。慢性炎癥與多種疾病相關(guān)，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 動(dòng)脈粥樣硬化、局部缺血性心臟病、牙周炎、結(jié)腸炎和一些癌癥。
[0003] 炎性反應(yīng)由涉及局部血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的生化事件以及受損組織內(nèi)的多種細(xì) 胞級(jí)聯(lián)組成。所述過(guò)程涉及釋放多種細(xì)胞來(lái)源的調(diào)節(jié)劑，包括組胺、干擾素-γ、白介素-8、 白三烯、一氧化氮、前列腺素、腫瘤壞死因子-α和白介素-1。特別地，白介素-I(IL-I)包 括細(xì)胞因子家族，所述細(xì)胞因子能刺激淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，活化吞噬細(xì)胞，增加前列腺素 生成，引起骨關(guān)節(jié)退化，提高骨髓細(xì)胞增殖，且參與許多慢性炎性病癥。IL-I能由巨噬細(xì)胞、 單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞產(chǎn)生，且可以是抵御感染的炎性反應(yīng)一部分。
[0004] IL-I作用模式可由白介素-1受體拮抗蛋白（IL-Ira ;也稱為" IRAP"）調(diào) 節(jié)。IL-Ira在細(xì)胞表面結(jié)合的受體與IL-I相同，因此防止IL-I向該細(xì)胞發(fā)送信號(hào)。 E-Ira從白細(xì)胞中分泌，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、多形核細(xì)胞（PMN)和其 它細(xì)胞，且能調(diào)節(jié)多種IL-I相關(guān)免疫和炎性反應(yīng)，如Arend WP，Malyak Μ，Guthridge CJ, Gabay C (1998)''Interleukin-lreceptor antagonist :role in biology^Annu. Rev. Immunol. 16:27-55所述。IL-Ira的生成由數(shù)種物質(zhì)刺激，包括粘附的免疫球蛋白G(IgG)、 其它細(xì)胞因子和細(xì)菌或病毒組分。IL-Ira以及其它細(xì)胞因子如可溶性腫瘤壞死因子受體 I (sTNF-Rl)、可溶性腫瘤壞死因子受體2(sTNF-R2)和可溶性白介素受體I (SlL-IRII)，是 關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎和肉芽腫性肺疾病中的重要天然抗炎蛋白質(zhì)。
[0005] IL-Ira能用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其中IL-I起關(guān)鍵作用的自身免疫疾病，減 少與該疾病相關(guān)的炎癥和軟骨降解。例如，Kineret?(阿那白滯素）是IL-Ira的重組、 非糖基化形式（加利福尼亞州千橡市的安進(jìn)公司（Amgen Manufacturing, Ltd.))。多種 重組白介素-1抑制劑和治療方法參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6, 599, 873, Sommer等，2003年7月29 日公開；美國(guó)專利號(hào)5, 075, 222, Hannum等，1991年12月24日公開；和美國(guó)申請(qǐng)公開號(hào) 2005/0197293，Mellis等，2005年9月8日公開。另外，包括使用自身體液在內(nèi)的從體液生 成IL-Ira的方法參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6, 623, 472, Reinecke等，2003年9月23日公開；美國(guó)專 利號(hào) 6, 713, 246, Reinecke 等，2004 年 3 月 30 日公開；和美國(guó)專利號(hào) 6, 759, 188, Reinecke 等，2004年7月6日公開。
[0006] 許多這類炎癥治療為本領(lǐng)域已知。本領(lǐng)域已知療法可涉及移除導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的潛 在刺激物或試劑，或通過(guò)調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)炎性反應(yīng)方面。示例包括糖皮質(zhì)激素留體（如氫 化可的松、可的松、強(qiáng)的松和倍氯米松）、非留體抗炎藥物（如阿司匹林、布洛芬和萘普生） 和免疫選擇性抗炎藥。然而，許多這類治療呈現(xiàn)副作用，特別是在慢性施用期間，或具有限 制其應(yīng)用的藥理學(xué)特性。例如，使用IL-Ira的組合物和方法為本領(lǐng)域已知，同時(shí)其可能與 涉及IL-Ira穩(wěn)定性和半衰期以及所提供IL-Ira量和速率的問(wèn)題相關(guān)。此外，許多治療對(duì)炎 癥過(guò)程的根本病因沒(méi)有作用。因此，需要改善的炎癥治療方法，提供一種或多種改進(jìn)功效、 減少副作用和提升給藥特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本技術(shù)提供富含抗炎性細(xì)胞因子的溶液產(chǎn)生方法以用于治療炎癥和其它由白介 素-1和腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的疾病。產(chǎn)生這類溶液的方法包括將液體體積的細(xì)胞因子 生成細(xì)胞（如白細(xì)胞）接觸固相提取材料，從液體移出固相提取材料。所述方法進(jìn)一步包 括以下一種或兩種：在液體與固相提取材料接觸期間或之后從液體移出細(xì)胞，從液體移出 固相提取材料后冷凍干燥（凍干）溶液。在一些實(shí)施方式中，液體體積的細(xì)胞獲自多種哺 乳動(dòng)物對(duì)象。此技術(shù)的組合物是非免疫原性的，能用于治療哺乳動(dòng)物對(duì)象，無(wú)論制備溶液所 用的細(xì)胞來(lái)源如何。
[0008] 特別地，本技術(shù)提供制備非免疫原性抗炎性細(xì)胞因子組合物的方法，包括含有以 下步驟的方法：
[0009] (a)從哺乳動(dòng)物供體獲得含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體，所述細(xì)胞如白細(xì)胞；
[0010] (b)將液體接觸固相提取材料以產(chǎn)生富含白介素 -1受體拮抗劑的組合物；和
[0011] (c)從組合物中移出細(xì)胞。
[0012] 方法還包括
[0013] (a)從哺乳動(dòng)物供體獲得含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體；
[0014] (b)將液體接觸固相提取材料以產(chǎn)生富含白介素 -1受體拮抗劑的組合物；和
[0015] (c)冷凍組合物以生成非免疫原性抗炎性細(xì)胞因子組合物。
[0016] 在其它實(shí)施方式中，方法包括：
[0017] (a)從哺乳動(dòng)物供體獲得含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體；
[0018] (b)將液體接觸固相提取材料以產(chǎn)生富含白介素 -1受體拮抗劑的組合物；和
[0019] (C)從固相提取材料分離液體；
[0020] (d)將所述組合物與儲(chǔ)液混合以制備貯存穩(wěn)定化的溶液；和
[0021] (e)冷藏穩(wěn)定化溶液。
[0022] 在各種實(shí)施方式中，含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體可包括全血、骨髓抽吸物、脂肪組 織、尿、其部分（如富血小板血漿和骨髓濃縮物）及其混合物，含有（例如）白細(xì)胞、脂肪基 質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞。所述固相提取材料可選自剛玉、石英、鈦、葡聚糖、瓊脂 糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和其組合。
[0023] 在一些實(shí)施方式中，含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體由包括以下步驟的方法制備：
[0024] (1)將含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的組織加樣到置有浮標(biāo)的管內(nèi)，其中所述浮標(biāo)的密度 使得浮標(biāo)能在管內(nèi)組織離心后可操作達(dá)到平衡位置，所述平衡位置在含細(xì)胞因子生成細(xì)胞 的第一部分和第二部分之間，第二部分的細(xì)胞濃度大于第一部分的細(xì)胞濃度；
[0025] (2)對(duì)管進(jìn)行離心，從而所述浮標(biāo)界定第一與第二部分之間的界面；和
[0026] (3)移出細(xì)胞部分以形成含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體。
[0027] 在各種實(shí)施方式中，所述獲得和接觸步驟包括：
[0028] (1)將含全血、骨髓抽吸物或兩者和抗凝劑的組織加樣到置有浮標(biāo)的管內(nèi)，其中所 述浮標(biāo)的密度使得浮標(biāo)能在管內(nèi)組織離心后達(dá)到平衡位置，所述平衡位置在含細(xì)胞因子生 成細(xì)胞的第一部分和第二部分之間，第二部分的細(xì)胞濃度大于第一部分的細(xì)胞濃度；
[0029] (2)對(duì)管進(jìn)行離心，從而所述浮標(biāo)界定第一與第二部分之間的界面；和
[0030] (3)收集第二部分，作為含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體；
[0031] (4)將第二部分加樣到含固相提取材料的濃縮器組件，溫育與固相提取材料接觸 的第二部分；和
[0032] (5)旋轉(zhuǎn)濃縮器組件，采用的離心速度能分離固相提取材料和富含白介素-1受體 拮抗劑的溶液，所述溶液的白介素-1受體拮抗劑濃度大于全血。
[0033] 在各種實(shí)施方式中，所述抗炎性細(xì)胞因子組合物包含
[0034] (i)白介素-1受體拮抗劑（IL-Ira)，濃度為至少約10, 000pg/ml ;
[0035] (ii)可溶性腫瘤壞死因子受體I (sTNF-Rl)，濃度為至少約1，200pg/ml ;和
[0036] (iii)蛋白質(zhì)，選自sTNF-RII (可溶性腫瘤壞死因子受體2)、IGF_I(胰島素樣生長(zhǎng) 因子I)、EGF (表皮生長(zhǎng)因子）、HGF (肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子）、TOGF-AB (來(lái)源于血小板的生長(zhǎng)因 子AB)、TOGF-BB(來(lái)源于血小板的生長(zhǎng)因子BB)、VEGF (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）、TGF-β 1(轉(zhuǎn) 化生長(zhǎng)因子β I)、sIL-lRII (可溶性白介素受體II)和其混合物，其中所述蛋白質(zhì)在所述組 合物中的濃度大于所述蛋白質(zhì)在正常血液中的濃度。
[0037] 在一些實(shí)施方式中，所述組合物額外包括白細(xì)胞、血小板或其組合。
[0038] 在人或其他哺乳動(dòng)物對(duì)象中治療白介素-1受體所介導(dǎo)病癥如炎癥的方法，包括 局部施用本技術(shù)的組合物。在各種實(shí)施方式中，所述組合物用細(xì)胞因子細(xì)胞懸液制備，所述 懸液獲自哺乳動(dòng)物對(duì)象或待治療對(duì)象之外的多種對(duì)象。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1的框圖描述生成抗炎性細(xì)胞因子組合物的方法；
[0040] 圖2是分級(jí)分離裝置的圖；
[0041] 圖3顯示在離心之前（圖3A)和之后（圖3B)激活樣品產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子的裝 置；
[0042] 圖4是產(chǎn)生血凝塊的裝置的圖；
[0043] 圖5是能產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子組合物的單一裝置的圖；
[0044] 對(duì)應(yīng)的參考數(shù)字指示附圖數(shù)個(gè)視圖中的對(duì)應(yīng)部分。應(yīng)指出，本文所列圖意在舉例 說(shuō)明本技術(shù)材料、組合物、裝置和方法的一般特征，以用于描述某些實(shí)施方式的目的。這些 圖不一定精確反映任意給定實(shí)施方式的特征，且不必定用于完整定義或限制本技術(shù)范圍內(nèi) 的特定實(shí)施方式。
[0045] 發(fā)明詳述
[0046] 下列技術(shù)描述僅示例一種或多種發(fā)明的組合物性質(zhì)、制造和應(yīng)用，且不意在限制 本申請(qǐng)或所述其他申請(qǐng)中要求權(quán)利的任何特定發(fā)明的范圍、實(shí)施和應(yīng)用，所述其他申請(qǐng)可 能提交要求對(duì)本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，或其中公開的專利。在本詳細(xì)描述的結(jié)尾處提供關(guān)于術(shù)語(yǔ) 和短語(yǔ)的非限制性討論，用于協(xié)助理解本技術(shù)。
[0047] 本技術(shù)涉及組合物、制備組合物的方法、使用組合物治療炎癥性疾病和由白介 素-1所介導(dǎo)其它疾病的方法。一般地，這類組合物由包括以下步驟的方法制備：
[0048] (a)從一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物對(duì)象獲得含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體（"細(xì)胞因子細(xì) 胞懸液"，如下進(jìn)一步所討論）；和
[0049] (b)分級(jí)分離液體以生成含一種或多種蛋白質(zhì)如白介素-1受體拮抗劑的蛋白質(zhì) 溶液。
[0050] 蛋白質(zhì)組合物
[0051] 本技術(shù)提供在人或其它哺乳動(dòng)物對(duì)象中治療由白介素-1所介導(dǎo)的炎癥性疾病和 其它疾病的方法，所述方法使用包含溶解、懸浮或另外攜帶從而以生理學(xué)可接受介質(zhì)形式 遞送給哺乳動(dòng)物對(duì)象的蛋白質(zhì)的組合物（本文稱為"蛋白質(zhì)溶液"）。在各種實(shí)施方式中， 所述組合物包含產(chǎn)自正常哺乳動(dòng)物對(duì)象全血的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞因子）。所述組合物還包含 活細(xì)胞，包括血小板、白細(xì)胞、和其組合。
[0052] 在各種實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)溶液包含至少2種選自以下的蛋白質(zhì)：IL_lra、 sTNF-RI、sTNF-RII (可溶性腫瘤壞死因子受體2)、IGF-I (胰島素樣生長(zhǎng)因子I)、EGF(表皮 生長(zhǎng)因子）、HGF (肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子）、TOGF-AB (來(lái)源于血小板的生長(zhǎng)因子AB)、TOGF-BB (來(lái) 源于血小板的生長(zhǎng)因子BB)、VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）、TGF- β 1 (轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β I )、 sIL-lRII (可溶性白介素受體II)，其中所述組合物的2種蛋白質(zhì)各自濃度均大于正常血液 中各蛋白質(zhì)的濃度。為清晰起見(jiàn)，所述蛋白質(zhì)溶液可包含來(lái)自所述組的3種或更多蛋白質(zhì)。 盡管所述組合物中每一種蛋白質(zhì)濃度可大于正常血液中其各自濃度，但不必定2種以上蛋 白質(zhì)的濃度大于正常血液中其各自濃度。
[0053] 在各種實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)溶液包括下列組分。
[0054] 表1.蛋白質(zhì)溶液示例性蛋白質(zhì)組分
[0055]

[0057] 蛋白質(zhì)濃度能用實(shí)施例4所示方法測(cè)量。
[0058] 優(yōu)選地，所述組合還包含活的白細(xì)胞、裂解的白細(xì)胞或兩者。在優(yōu)選組合物中，所 述蛋白質(zhì)溶液包含單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板。在各種實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)溶液包含下列組 分。
[0059] 表2.蛋白質(zhì)溶液示例性細(xì)胞組分
[0061] 應(yīng)理解該濃度為種特異性。此外，應(yīng)理解濃度可隨著個(gè)體對(duì)象而變化。因此，在包 括從含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的血液或其它組織生成蛋白質(zhì)溶液的方法中，所述蛋白質(zhì)溶液的 蛋白質(zhì)和細(xì)胞濃度可與上述不同；上述值是濃度均值，如對(duì)象群體中所見(jiàn)。
[0062] 在各種實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)溶液中一種或多種蛋白質(zhì)或其它組分的濃度大于 正常血液中該組分的濃度。（具有所述更高組分濃度的組合物被稱為"富含"這些組分。） 如本文所示，"正常"血液或其它組織中的組分濃度是獲得組織的哺乳動(dòng)物對(duì)象一般群體中 所見(jiàn)濃度，例如正常全血中。在抗炎性細(xì)胞因子組合物獲自特定對(duì)象組織的方法中，蛋白質(zhì) 或細(xì)胞的"正常"濃度可以是進(jìn)行加工獲得蛋白質(zhì)或細(xì)胞之前的個(gè)體血液中的濃度。
[0063] 因此，在各種實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)溶液中一種或多種組分的濃度比正常血液 中該組分濃度高大于約1. 5倍、約2倍或約3倍。例如，相對(duì)于正常（全）血，組合物中的 組分可具有更高濃度，如下所示：
[0064] · IL-lra，濃度高至少2. 5倍、或至少3倍或至少5倍；
[0065] · sTNF-RI，濃度高至少2倍、或至少2. 5倍或至少3倍；
[0066] · sTNF-RII，濃度高至少2倍、或至少2. 5倍或至少3倍；
[0067] · SlL-IRII，濃度高至少1. 5倍、或至少1. 8倍或至少2倍；
[0068] · EGF，濃度高至少2倍、或至少3倍或至少5倍；
[0069] · HGF，濃度高至少2倍、或至少3倍或至少4倍；
[0070] · H)GF-AB，濃度高至少2倍、或至少3倍或至少5倍；
[0071 ] · PDGF-BB，濃度高至少2倍、或至少3倍或至少5倍；
[0072] · TGF- β 1，濃度高至少3倍、或至少4倍或至少6倍；
[0073] · IGF-I，濃度高至少1. 2倍、或至少1. 4倍或至少1. 5倍；
[0074] · VEGF，濃度高至少2倍、或至少2. 5倍或至少3倍；
[0075] ?白細(xì)胞，濃度高至少約2倍、或至少約3倍或至少約4倍；
[0076] ?血小板，濃度高至少約2倍、或至少約3倍或至少約4倍；
[0077] ?中性粒細(xì)胞，濃度高至少1. 5倍、或至少2倍或至少3倍；
[0078] ?單核細(xì)胞，濃度高至少3倍、或至少4倍或至少6倍；
[0079] ?淋巴細(xì)胞，濃度高至少5倍、或至少8倍或至少10倍；和
[0080] ?嗜堿性細(xì)胞，濃度高至少2倍、或至少4倍或至少6倍。
[0081 ] 同樣，所述蛋白質(zhì)溶液中的紅細(xì)胞濃度優(yōu)選是正常血液中紅細(xì)胞濃度的至少一 半，或至少三分之一。
[0082] 例如，蛋白質(zhì)溶液可包含：
[0083] (a)至少約 10, 000pg/ml ILl-ra ;
[0084] (b)至少約 1，200pg/ml sTNF-RI ;和
[0085] (c)蛋白質(zhì)，選自 sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β 1、 和sIL-lRII以及其混合物，其中所述蛋白質(zhì)的濃度大于正常血液中該蛋白質(zhì)的基線濃度。 另一示例中，蛋白質(zhì)溶液包含：
[0086] (a)白介素-1受體拮抗劑（IL-Ira)，濃度比正常血液中IL-Ira濃度高至少3倍；
[0087] (b)可溶性組織壞死因子因子-rl (sTNF-rl)，濃度比正常血液中IL-Ira濃度高至 少2倍；
[0088] (c)白細(xì)胞，濃度比正常血液中白細(xì)胞濃度高至少2倍；和
[0089] (d)血小板，濃度比正常血液中血小板濃度高至少2倍。