內(nèi)皮功能障礙和炎癥的疾病的治療的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 優(yōu)先權(quán)細(xì)節(jié)
[0002] 本申請(qǐng)要求于2012年12月12日提交的名稱為"內(nèi)皮功能障礙和炎癥的疾病的治 療"的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/736, 361的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容在此通過(guò)引用并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開(kāi)設(shè)及用于治療或預(yù)防內(nèi)皮功能障礙或炎癥的疾病及其相關(guān)病癥的方法。 技術(shù)背景
[0004]內(nèi)皮功能障礙的特征為內(nèi)皮作用向著降低血管舒張、促炎性狀態(tài)和促凝血特性 變化。血管生物學(xué)家通常認(rèn)為具有導(dǎo)致功能障礙的內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化中的啟動(dòng)事 件（Ross化化re 362:801 - 9, 1993)并且在冠屯、病缺血性臨床表現(xiàn)中起重要作用。內(nèi)皮 功能障礙還先于動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)際存在巧eddy et al., J Am Coll Cardiol 23:833 -843, 1994)。它還與大多形式的屯、血管?。ㄈ绺哐獕骸⒐跔顒?dòng)脈疾病、慢性屯、力衰竭和外周動(dòng) 脈疾病）、糖尿病并發(fā)癥（如腎病）和慢性腎衰竭相關(guān)。
[0005] 在內(nèi)皮功能障礙中參與降低的血管舒張反應(yīng)的機(jī)制包括降低的一氧化氮形 成、氧化過(guò)度W及減少超極化因子產(chǎn)生。粘附分子的上調(diào)、趨化因子如巨隧細(xì)胞趨化膚 (chemoattractant peptide)-1的形成、W及纖溶酶原激活物抑制劑-1的產(chǎn)生參與了炎癥 反應(yīng)并有助于促凝血狀態(tài)。血管活性膚如血管緊張素II和內(nèi)皮素-1 ;不對(duì)稱二甲基精氨酸 (內(nèi)源性一氧化氮抑制劑）的累積；高膽固醇血癥；高同型半脫氨酸血癥；改變的膜島素信 號(hào)；W及高血糖癥可促進(jìn)運(yùn)些不同的機(jī)制。例如，在與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的病癥中觀測(cè)到血 管緊張素II過(guò)量。血管緊張素II被認(rèn)為是血管緊張素I的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，與血管緊張素I 一起參與抑制內(nèi)皮增厚，促進(jìn)內(nèi)皮存活，使支持血管周圍的細(xì)胞穩(wěn)定W及抑制內(nèi)皮通透性。 過(guò)量水平的血管緊張素II抑制運(yùn)些有益效果。
[0006] 內(nèi)皮功能障礙還是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的重要早期事件，促進(jìn)血小板啟動(dòng)和進(jìn)展。
[0007] 內(nèi)皮功能障礙還是炎性疾病如敗血癥效果的主要促成者。敗血癥的發(fā)病是復(fù)雜網(wǎng) 絡(luò)事件的結(jié)果。革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組分（內(nèi)毒素）是造成敗血癥發(fā)生的主要（雖 然不是唯一的）種類。除了其他細(xì)菌分子之外，內(nèi)毒素引發(fā)設(shè)及促炎性介質(zhì)和抗炎性介質(zhì) 產(chǎn)生的細(xì)胞和體液途徑的普遍反應(yīng)。運(yùn)些介質(zhì)包括細(xì)胞因子、凝血因子、粘附分子、屯、肌抑 制物和和熱休克蛋白。內(nèi)皮是敗血癥-誘導(dǎo)的事件的主要祀標(biāo)，并且內(nèi)皮細(xì)胞受損和功能 障礙在敗血性休克的病理學(xué)中占很大比例。血管內(nèi)皮細(xì)胞是機(jī)體與循環(huán)的細(xì)菌分子首先相 接觸的細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞具有識(shí)別細(xì)菌病原體的結(jié)構(gòu)模式并且隨后啟動(dòng)炎性介質(zhì)的表達(dá)的機(jī) 制。
[0008] 用于治療內(nèi)皮功能障礙的方法是處理疾病過(guò)程中引起內(nèi)皮功能障礙的組分。例 如，通過(guò)補(bǔ)充葉酸降低高同型半脫氨酸血癥中的同型半脫氨酸水平可改善內(nèi)皮功能障礙。 心精氨酸和四氨生物嚷嶺W及四氨生物嚷嶺模擬物可通過(guò)增強(qiáng)一氧化氮的生物利用度而 改善內(nèi)皮功能。然而，一些研究并未發(fā)現(xiàn)給予k精氨酸能改善內(nèi)皮功能障礙。
[0009] 已證實(shí)他汀類藥物對(duì)內(nèi)皮功能障礙具有有益效果，運(yùn)可能部分是脂質(zhì)降低的結(jié) 果，也是其多效抗炎效應(yīng)的結(jié)果。然而，他汀類藥物與肌肉疼痛和橫紋肌溶解（其可導(dǎo)致腎 衰竭和死亡）、肌無(wú)力、神經(jīng)病變和健忘相關(guān)。此外，他汀類藥物具有相對(duì)短的半衰期并且需 要定期給藥W提供療效。例如，阿托伐他汀具有約20-30小時(shí)的有效半衰期并且被認(rèn)為是 長(zhǎng)效的他汀類藥物。
[0010] 還表明過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體丫激動(dòng)劑改善內(nèi)皮功能障礙。然而，應(yīng)當(dāng)針 對(duì)與運(yùn)類化合物相關(guān)的安全考慮而小屯、評(píng)估運(yùn)些化合物的潛在益處，所述安全考慮設(shè)及對(duì) 液體滯留和充血性屯、力衰竭W及可能增加屯、血管風(fēng)險(xiǎn)。
[0011] 通過(guò)前述清楚地可知，本領(lǐng)域?qū)χ委熁蝾A(yù)防內(nèi)皮功能障礙或炎癥的疾病存在需 要。
[001引簡(jiǎn)述
[0013] 在得到本發(fā)明中，本發(fā)明人表明，全身（如通過(guò)靜脈）給予患有內(nèi)皮功能障礙的動(dòng) 物表達(dá)STRO-I的間充質(zhì)祖細(xì)胞或其后代增加了冠狀動(dòng)脈對(duì)內(nèi)皮特異性擴(kuò)張劑（緩激膚和 卡己膽堿）的反應(yīng)，但沒(méi)有增加對(duì)平滑肌擴(kuò)張劑硝普鋼的反應(yīng)。例如，相比沒(méi)有用MPC或其 后代治療的動(dòng)物中的結(jié)果，MPC或其后代增加對(duì)內(nèi)皮特異性擴(kuò)張劑的最大反應(yīng)，其指示降低 的內(nèi)皮功能障礙。運(yùn)些數(shù)據(jù)表明表達(dá)STRO-I的MPC或其后代或由它們分泌的一種或多種 因子治療或預(yù)防內(nèi)皮功能障礙的發(fā)展。
[0014] 基于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本公開(kāi)提供了用于治療或預(yù)防個(gè)體的血管內(nèi)皮功能障礙或 炎癥的疾病的方法，所述方法包括全身給予個(gè)體富集STRO-r細(xì)胞的細(xì)胞群和/或其后代 和/或源自它們的可溶性因子。.
[0015] 在一實(shí)例中，所述個(gè)體患有由內(nèi)皮功能障礙引起的病癥。
[0016] 在一實(shí)例中，所述內(nèi)皮功能障礙位于血管內(nèi)，例如為血管內(nèi)皮功能障礙。
[0017] 在一實(shí)例中，由內(nèi)皮功能障礙引起的病癥選自：敗血癥、高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病、慢 性屯、力衰竭和外周動(dòng)脈疾病、腎病及慢性腎衰竭。
[001引在一實(shí)例中，由內(nèi)皮功能障礙引起的病癥為腎病。因而，在一實(shí)例中，本公開(kāi)提供 了用于治療或預(yù)防個(gè)體腎病的方法，所述方法包括全身給予個(gè)體富集STRO-r細(xì)胞的細(xì)胞 群和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子。
[0019] 在一實(shí)例中，所述腎病為糖尿病腎病。因而，在一實(shí)例中，本公開(kāi)提供了用于治療 或預(yù)防個(gè)體糖尿病腎病的方法，所述方法包括全身給予個(gè)體富集STRO-r細(xì)胞的細(xì)胞群和/ 或其后代和/或源自它們的可溶性因子。
[0020] 在另一實(shí)例中，所述病癥為動(dòng)脈粥樣硬化。因而，在一實(shí)例中，本公開(kāi)提供了用于 治療或預(yù)防個(gè)體動(dòng)脈粥樣硬化的方法，所述方法包括全身給予個(gè)體富集STRO-r細(xì)胞的細(xì) 胞群和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子。
[0021] 在一實(shí)例中，所述疾病為炎癥疾病。炎癥疾病可W為全身炎癥反應(yīng)綜合征，如敗血 癥、敗血性休克或敗血癥樣病癥。在另一實(shí)例中，所述病癥為敗血癥或敗血性休克。因而， 在一實(shí)例中，本公開(kāi)提供了用于治療或預(yù)防個(gè)體敗血癥或敗血性休克的方法，所述方法包 括全身給予個(gè)體富集STRO-r細(xì)胞的細(xì)胞群和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子。
[0022] 敗血癥、敗血性休克或敗血癥樣病癥可由病毒、真菌、原生動(dòng)物或細(xì)菌引起。
[0023] 在一實(shí)例中，所述方法包括給予富集STRO-I胃細(xì)胞的細(xì)胞群和/或其后代和/或 源自它們的可溶性因子。
[0024] 在一實(shí)例中，所述富集STRO-r細(xì)胞的細(xì)胞群和/或其后代和/或源自它們的可 溶性因子通過(guò)靜脈給予。在運(yùn)方面，本發(fā)明人已表明，全身給予STRO-r細(xì)胞和/或其后 代能夠改善內(nèi)皮功能障礙。因而，本公開(kāi)考慮在個(gè)體遠(yuǎn)離內(nèi)皮功能障礙部位的位置處給予 STRO-r細(xì)胞和/或其后代。
[002引在一實(shí)例中，W足W減少個(gè)體IL-6、TNFa和/或IL-17的量給予STRO-r細(xì)胞和 /或其后代和/或源自它們的可溶性因子。通過(guò)減少運(yùn)些炎性細(xì)胞因子的水平，本公開(kāi)的方 法預(yù)防了內(nèi)皮功能障礙。
[0026] 在一實(shí)例中，W足W增加個(gè)體（如個(gè)體內(nèi)皮中）血管生成素I水平的量給予 STRO-r細(xì)胞和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子。如上所述，血管生成素II (血管生 成素I的括抗劑）的水平在患有內(nèi)皮功能障礙的個(gè)體中提高。本發(fā)明人已表明，STRO-rMPC 和/或其后代分泌血管生成素II，推斷運(yùn)將有助于治療內(nèi)皮功能障礙。
[0027] 在一實(shí)例中，W足W增強(qiáng)個(gè)體內(nèi)皮（如，血管內(nèi)皮）擴(kuò)張（如，在應(yīng)答諸如緩激膚 或卡己膽堿的內(nèi)皮擴(kuò)張劑時(shí)）的量給予STRO-r細(xì)胞和/或其后代和/或源自它們的可溶 性因子。
[0028] 在一實(shí)例中，STRO-r細(xì)胞和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子W足W增強(qiáng) 個(gè)體內(nèi)皮（如，血管內(nèi)皮）擴(kuò)張而不增強(qiáng)平滑?。ㄈ纾芷交。U(kuò)張（如，在應(yīng)答諸如 硝普鋼的平滑肌擴(kuò)張劑時(shí)）的量給予。
[0029] 細(xì)胞的示例性劑量包括每千克0. 1 X IO6至5 X 10 6STRO-I+細(xì)胞和/或其后代。例 如，所述方法包括每千克給予0. 3 X IO6至2 X 10 6STRO-I+細(xì)胞和/或其后代。
[0030] 在一實(shí)例中，將細(xì)胞W約0. 3 X IO6細(xì)胞Ag至約4 X 10 6細(xì)胞Ag的劑量給予，如 約0. 3 X IO6細(xì)胞Ag至約2 X 10 6細(xì)胞/kg。
[0031] 本方法的一種方式設(shè)及給予低劑量STRO-r細(xì)胞和/或其后代。運(yùn)種低劑量為， 例如 0. 1 X 1〇5至約 0. 5 X 10 6STRO-I+細(xì)胞 Ag,如約 0. 3 X 10 6STRO-I+細(xì)胞 /kg。
[0032] 在另一實(shí)例中，將高劑量的細(xì)胞給予個(gè)體。示例性劑量包括至少約1. 5 X IO6細(xì)胞 Ag。例如，高劑量包括約1. 5X IO6至約4X 10 6細(xì)胞/kg。例如，高劑量包括約1. 5X 10 6或 約2X IO6細(xì)胞/kg。
[0033] 在一實(shí)例中，隊(duì)直定的身體劑量化Ody dose)給予細(xì)胞，即不考慮個(gè)體體重。
[0034] 在一實(shí)例中，不考慮個(gè)體體重，W約10000萬(wàn)至30000萬(wàn)細(xì)胞的劑量給予細(xì)胞。
[0035] 在一實(shí)例中，不考慮個(gè)體體重，W約10000萬(wàn)至20000萬(wàn)細(xì)胞的劑量給予細(xì)胞。
[0036] 在一實(shí)例中，不考慮個(gè)體體重，W約10000萬(wàn)細(xì)胞的劑量給予細(xì)胞。
[0037] 在一實(shí)例中，不考慮個(gè)體體重，W約15000萬(wàn)細(xì)胞的劑量給予細(xì)胞。
[0038] 在一實(shí)例中，不考慮患者體重，W約20000萬(wàn)細(xì)胞的劑量給予細(xì)胞。
[0039] 在一實(shí)例中，不考慮患者體重，W約30000萬(wàn)細(xì)胞的劑量給予細(xì)胞。
[0040] 在一實(shí)例中，將STRO-r細(xì)胞和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子與多硫 酸化聚糖相組合給予。
[0041] 在另一實(shí)例中，所述多硫酸化聚糖為戊聚糖多硫酸醋（PP巧或其藥學(xué)可接受的 鹽，例如，所述PPS為PPS的鋼鹽（NaPP巧或PPS的巧鹽（CaPPS)。例如，PPS的鹽為NaPPS。
[0042] 在一實(shí)例中，所述PPS的濃度依賴于組合物中STRO-r細(xì)胞和/或其后代和/或 源自它們的可溶性因子的數(shù)目。
[004引在一實(shí)例中，所述PPS的濃度為約5ng/ml/百萬(wàn)細(xì)胞至lOmg/ml/百萬(wàn)細(xì)胞或 500ng/ml/百萬(wàn)細(xì)胞至lOmg/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，500ng/ml/百萬(wàn)細(xì)胞至2000 y g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞， 1 y g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞至1000 Ji g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，或1 Ji g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞至500 Ji g/ml/百萬(wàn)細(xì) 胞，500ng至10 y g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，1 y g至10 y g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，1 y g至8 y g/ml/百萬(wàn)細(xì) 胞，1 y g至6 Ji g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，1 Ji g至5 Ji g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，1 Ji g至3 Ji g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞， 2 y邑至6 y邑/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，2. 5 y邑至5 y邑/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，或3 y邑至5 y邑/ml/百萬(wàn)細(xì)胞， 1 Ji g至100 Ji g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，1 Ji g至50 Ji g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，1 Ji g至20 Ji g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞， 1 y g至15 y g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，10 y g至100 y g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，20 y g至100 y g/ml/百萬(wàn)細(xì) 胞，或 50 Ji g 至 100 Ji g/ml/ 百萬(wàn)細(xì)胞，1 Ji g 至 1000 Ji g/ml/ 百萬(wàn)細(xì)胞，100 Ji g 至 800 Ji g/ ml/百萬(wàn)細(xì)胞，100 y g至600 y g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，100 y g至500 y g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞，200 y g至 500 Ji g/ml/百萬(wàn)細(xì)胞。
[0044] 在一實(shí)例中，PPS的量為約Img至lOOmg/7500萬(wàn)細(xì)胞，例如約25-75mg/7500萬(wàn)細(xì) 胞，如，約75mg/7500萬(wàn)細(xì)胞（如，Img/百萬(wàn)細(xì)胞）。
[0045]在進(jìn)一步的實(shí)例中，PPS 的濃度為約 500ng，liig，2iig，2.5iig，5iig，10yg， 15 Ji g，20 Ji g，30 Ji g，40 Ji g，50 Ji g，60 Ji g，70 Ji g，80 Ji g，90 Ji g，100 Ji g，150 Ji 邑，200 Ji g， 250 y 邑，300 y 邑，350 y 邑，400 y 邑，450 y 邑，500 y 邑，550 y 邑，GOO y 邑，G50 y 邑，了00 y 邑，了50 y 邑， 800 Ji g,850 Ji g,900 Ji g,950 y g, 1000 y g, 1050 y g, 1100 y g, 1150 y g, 1200 y g, 1250 y g, 1300 y g，1350 y g，1400 y g，1450 y g，1500 y g，1550 y g，1600 y g，1650 y g，1700 y g， 1750 y g，1800 y g，1850 y g，1900 y g，1950 y g，或 2000 y g/ml/ 百萬(wàn)細(xì)胞。
[004引例如，給予的PPS總量為約I至lOOmg。
[0047] 例如，給予的PPS總量為約75mg。
[0048] 在另一實(shí)例中，可W諸如W在每毫升待給予個(gè)體的組合物中產(chǎn)生0.0 l至100微克 PPS的濃度的量給予PPS，例如，每毫升組合物0. 1至50微克，每毫升組合物0. 1至50微克， 每毫升組合物0. 1至10微克，每毫升組合物1至10微克，每毫升組合物2至8微克，每毫 升組合物4至6微克，或者每毫升組合物4、5或6微克。
[0049] 在一實(shí)例中，將富集STRO-r細(xì)胞的細(xì)胞群和/或其后代和/或源自它們的可溶 性因子與PPS -起或不與PPS -起每周一次或更少給予，如每四周一次或更少。
[0050] 本公開(kāi)還考慮多次給予細(xì)胞和/或可溶性因子。例如，運(yùn)種方法可包括給予細(xì)胞 并監(jiān)測(cè)個(gè)體W確定何時(shí)內(nèi)皮功能障礙的一種或多種癥狀出現(xiàn)或重現(xiàn)，W及給予進(jìn)一步劑量 的細(xì)胞和/或可溶性因子。評(píng)估內(nèi)皮功能障礙癥狀的合適方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易 見(jiàn)的和/或如本文所述。
[0051] 在另一實(shí)例中，將細(xì)胞和/或可溶性因子按固定時(shí)間表給予，例如，一周或兩周或 =周或四周或五周或六周或更長(zhǎng)時(shí)間一次。
[0052] 在一實(shí)例中，富集STRO-r細(xì)胞的細(xì)胞群和/或后代細(xì)胞為自體或同種異體的，和 /或可溶性因子可源自自體或同種異體細(xì)胞。
[0053] 在一實(shí)例中，在給予前和/或獲得可溶性因子之前，將富集STRO-r細(xì)胞的細(xì)胞群 和/或后代細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增。 ^
[0054] 在一實(shí)例中，富集STRO-r細(xì)胞的細(xì)胞群為STRO-I胃和/或表達(dá)組織非特異性堿 性憐酸酶燈NAP)，和/或后代細(xì)胞和/或可溶性因子源自為STRO-I胃和/或表達(dá)TNAP的 STRO-r 細(xì)胞。
[0055] 在一實(shí)例中，將STRO-r細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自它們的可溶性因子W 組合物的形式給予，所述組合物包括所述STRO-r細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自它們 的可溶性因子W及載體和/或賦形劑。
[0056] 在一實(shí)例中，所述個(gè)體為哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類動(dòng)物，如人類。在另一實(shí)例中，所述 個(gè)體為非人的動(dòng)物（如非人的哺乳動(dòng)物），如家養(yǎng)哺乳動(dòng)物，如狗或貓或馬或?；蚓d羊。
[0057] 本公開(kāi)另外提供了富集STRO-r細(xì)胞的細(xì)胞群和/或其后代和/或源自它們的可 溶性因子，任選地與PPS相組合，用于治療或預(yù)防個(gè)體內(nèi)皮功能障礙或由內(nèi)皮功能障礙引 起的病癥。
[0058] 本公開(kāi)另外提供了富集STRO-I+細(xì)胞的細(xì)胞群和/或其后代和/或源自它們的可 溶性因子，任選地與PPS相組合，在制備用于治療或預(yù)防個(gè)體內(nèi)皮功能障礙或由內(nèi)皮功能 障礙引起的病癥中的應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0059] 圖1.由成人骨髓單個(gè)核細(xì)胞度MMNC)共表達(dá)TNAP (STR0-3)和間充質(zhì)前體細(xì)胞標(biāo) 志物-STRO-I胃。雙色免疫巧光和流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)解育STRO-I MACS-選擇的BMMNC來(lái)進(jìn)行， 用與FITC結(jié)合的山羊抗-鼠IgM抗體間接標(biāo)記（X軸），W及用與PE結(jié)合的山羊抗-鼠IgG 間接標(biāo)記的STR0-3mAb (鼠IgGl) (y軸）。點(diǎn)狀直方圖代表W列表型（Iistmode)數(shù)據(jù)收集 的5X IO4個(gè)事件。將垂直線和水平線設(shè)定為反應(yīng)水平 < 利用在相同條件下處理的同種型 匹配對(duì)照抗體-IBS(IgG)和1A6. 12 (IgM)獲得的平均巧光的1.0%。結(jié)果證明，STRO-I胃細(xì) 胞的較小群共表達(dá)TNAP (右上象限），而剩余的STRO-r細(xì)胞不能與STR0-3mAb反應(yīng)。
[0060] 圖2.培養(yǎng)和擴(kuò)增的STRO-I亮MPC的STRO-I胃或STR0-1?*后代的基因表達(dá)譜。離 體擴(kuò)增的骨髓MPC的單細(xì)胞懸液通過(guò)膜蛋白酶/EDTA處理來(lái)制備。將細(xì)胞用STRO-I抗體 染色，隨后通過(guò)與山羊-抗鼠IgM-異硫氯酸巧光素解育來(lái)顯現(xiàn)。巧光活化細(xì)胞分選之后 (A)，由表達(dá)STR0-1?*或STRO-I胃的細(xì)胞的純化群制備總細(xì)胞RNA。利用RNAzoIB提取法 和標(biāo)準(zhǔn)程序，從每個(gè)亞細(xì)胞群中分離總RNA并用作CDNA合成的模板。使用如前所述的標(biāo)準(zhǔn) 方案（Gronthos et al. J Cell Sci. 116:1827-1835, 2003)，通過(guò) PCR 擴(kuò)增來(lái)評(píng)估不同轉(zhuǎn)錄 物的表達(dá)。在本研究中使用的引物組顯示于表2中。擴(kuò)增之后，每一反應(yīng)混合物通過(guò)1. 5% 瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分析并通過(guò)漠化乙錠染色顯現(xiàn)度）。利用ImageQant軟件，參照管家基因 GAPDH的表達(dá)來(lái)評(píng)估各個(gè)細(xì)胞標(biāo)志物的相對(duì)基因表達(dá)（C)。
[0061]圖3.培養(yǎng)和擴(kuò)增的STRO-rMPC的STRO-I胃后代表達(dá)高水平的SDF-I，STR0-1?*后 代則沒(méi)有。（A)利用FACS，根據(jù)STRO-I胃和STR0-1?*/?區(qū)域，將嫩CS-分離的STRO-rBMMNC 制備物分成不同的STRO-I亞集。從各個(gè)STRO-I亞群制備總RNA并用于構(gòu)建STRO-I胃消減 雜交庫(kù)度-C)。復(fù)制硝化纖維素濾膜，其已具有從用STRO-I胃消減的CDNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌克隆 擴(kuò)增的代表性PCR產(chǎn)物的印跡。接著用[ 32門脫氧胞巧S憐酸（dCT巧-標(biāo)記的STRO-I胃度） 或STR0-1?*/?消減的CDNA(C)來(lái)探測(cè)濾膜。箭頭指示含有對(duì)應(yīng)于人SDF-I的CDNA片段的 1個(gè)克隆的差異表達(dá)。值）逆轉(zhuǎn)錄酶（RT)-PCR分析，其顯示了培養(yǎng)前由新鮮的MCS/