DOTAP-mPEG-PLA納米粒及其納米粒溶液、載藥復(fù)合物和制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及DOTAP-mPEG-PLA納米粒及其納米粒溶液、載藥復(fù)合物和制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]基因?qū)胂到y(tǒng)在基因功能研究和基因治療中有重要應(yīng)用。目前使用的基因?qū)胂到y(tǒng)主要包括兩大類:病毒載體和非病毒載體。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺病毒相關(guān)載體，可高效地將治療基因傳遞到細(xì)胞內(nèi)，但其規(guī)模生產(chǎn)難度大，可遞送的基因容量小，易引起免疫反應(yīng)，有潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。非病毒基因載體包括脂質(zhì)體、陽(yáng)離子納米粒、無(wú)機(jī)納米粒子載體等，具有免疫原性低，安全性較好，易大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)，是當(dāng)前基因?qū)胂到y(tǒng)研究的熱點(diǎn)。
[0003]甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(Methoxypoly (ethylene glycol)-poly (lactide)，簡(jiǎn)稱mPEG-PLA)雙嵌段聚合物是一種可降解、生物相容性好的兩親性聚合物，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有重要的應(yīng)用。在20世紀(jì)90年代，含有PEG或PLA傳輸載體裝載的藥物已獲得了美國(guó)FDA的批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。mPEG-PLA共聚物含有親水嵌段PEG和疏水嵌段PLA，可在水溶液中自組裝成納米顆粒，在藥物、基因?qū)胂到y(tǒng)中有很好的應(yīng)用前景。目前，mPEG-PLA雙嵌段聚合物納米粒載體包裹的紫杉醇制劑已在韓國(guó)和歐洲應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療，在美國(guó)也已進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)。在將PEG-PLA納米粒用于基因?qū)胂到y(tǒng)時(shí)，單純采用mPEG-PLA納米粒裝載基因的難度大，且轉(zhuǎn)染效率低。進(jìn)一步對(duì)mPEG-PLA納米粒進(jìn)行物理或化學(xué)修飾，可制備出具有易裝載基因、轉(zhuǎn)染效率高、毒性低、可降解的新型納米粒，在基因?qū)胫杏兄匾膽?yīng)用，在基因功能研究、基因治療研究及臨床應(yīng)用中有很好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新的修飾手段用以修飾mPEG-PLA雙嵌段共聚物，發(fā)明人采用D0TAP修飾兩親性mPEG-PLA雙嵌段共聚物，利用自組裝的方法制備得到新型的可降解性基因載體，即DOTAP-mPEG-PLA陽(yáng)離子納米粒，可簡(jiǎn)稱為DPP納米粒。本發(fā)明DPP納米粒具有良好的DNA結(jié)合能力，可有效地將基因質(zhì)粒導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞中，具有轉(zhuǎn)染率高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]本發(fā)明中所采用的兩親性陽(yáng)離子物質(zhì)D0TAP，化學(xué)命名為(2，3_二油氧基丙基)三甲基氯化銨，簡(jiǎn)稱D0TAP。
[0006]本發(fā)明中所采用的兩親性mPEG-PLA共聚物，甲氧基聚乙二醇-聚乳酸，簡(jiǎn)稱mPEG-PLA。甲氧基聚乙二醇-聚乳酸納米顆粒具有兩親性、良好的生物可降解性和生物相容性、避免了吞噬細(xì)胞吞■、增加了藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間和生物利用度，持續(xù)釋放和靶向傳遞從而增加了藥效、減小了副作用。mPEG-PLA納米粒不僅可以作為化學(xué)藥物、蛋白質(zhì)和疫苗等的載體，同時(shí)也可以作為基因藥物的載體。
[0007]本發(fā)明利用自組裝的方法制備DOTAP-mPEG-PLA納米粒，按照下述配比關(guān)系取原料、溶劑進(jìn)行制備:
[0008]原料:mPEG-PLA共聚物與D0TAP的質(zhì)量比為:mPEG_PLA共聚物70-99份、D0TAP1-30 份；
[0009]溶劑:二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷等易揮發(fā)的溶劑中的至少一種；
[0010]水化溶液:雙蒸水、去離子水、純水、生理鹽水；
[0011]制備方法:mPEG-PLA共聚物、D0TAP分別溶于溶劑中，然后將溶劑蒸發(fā)，加適量水化溶液水化直到完全溶解，所得溶液即為DPP納米粒溶液。
[0012]將所述透明液體干燥即得DOTAP-mPEG-PLA納米粒。
[0013]進(jìn)一步優(yōu)選的，本發(fā)明DPP納米粒，按照下述配比關(guān)系取原料進(jìn)行制備:
[0014]原料:mPEG-PLA共聚物與D0TAP的質(zhì)量比為:mPEG_PLA共聚物85-95份、D0TAP5-15 份。
[0015]上述技術(shù)方案中，溶劑用量以能夠溶解原料即可。
[0016]本發(fā)明DOTAP-mPEG-PLA納米粒的平均粒徑為73±6nm，平均電位為+46±2mV，具備良好的DNA結(jié)合能力。與金標(biāo)轉(zhuǎn)染材料PEI 25K相比，本發(fā)明DPP納米粒具有更高的轉(zhuǎn)染能力和較低的細(xì)胞毒性。
[0017]本發(fā)明DOTAP-mPEG-PLA納米?？捎糜谪?fù)載活性成分，尤其是基因、化學(xué)藥物、蛋白質(zhì)和疫苗，得到DOTAP-mPEG-PLA納米粒復(fù)合物。
[0018]DOTAP-mPEG-PLA納米粒屬生物可降解性陽(yáng)離子納米粒，是一種新型基因?qū)胂到y(tǒng)非病毒載體。該納米粒能通過(guò)靜電相互作用結(jié)合DNA，可以有效地將目的基因或化學(xué)藥物、蛋白質(zhì)和疫苗等活性成分導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，其本身具有細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染率高等特征。
[0019]如，可以采用DOTAP-mPEG-PLA納米粒傳遞水泡口炎病毒基質(zhì)蛋白(VSVMP)基因質(zhì)粒，即采用DOTAP-mPEG-PLA納米粒負(fù)載VSVMP得到VSVMP/DPP復(fù)合物。
[0020]本發(fā)明VSVMP/DPP復(fù)合物，包括下述配比關(guān)系的原料及輔料:
[0021 ]原料:DOTAP-mPEG-PLA 納米粒與 VSVMP 質(zhì)量比為:DOTAP-mPEG-PLA 納米粒 1_99份，VSVMP 1 份；
[0022]滲透壓調(diào)節(jié)劑適量，用量以配制所得VSVMP/DPP復(fù)合物達(dá)到生理滲透壓即可；
[0023]溶劑:注射用水、雙蒸水、去離子水、純水或生理鹽水；
[0024]制備方法如下:
[0025]將上述原料及溶劑按照滲透壓調(diào)節(jié)劑、溶劑、DOTAP-mPEG-PLA納米粒和VSVMP依次混合即得VSVMP/DPP復(fù)合物溶液，所得溶液達(dá)到生理滲透壓。
[0026]進(jìn)一步優(yōu)化，本發(fā)明VSVMP/DPP復(fù)合物按照下述配比關(guān)系取原料進(jìn)行制備:
[0027]所述VSVMP/DPP復(fù)合物，包括下述配比關(guān)系的原料及輔料:原料:DOTAP-mPEG-PLA納米粒與VSVMP質(zhì)量比為DOTAP-mPEG-PLA納米粒90-99份，VSVMP 1-10份。
[0028]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用DOTAP-mPEG-PLA納米粒傳遞VSVMP基因質(zhì)粒可應(yīng)用于體外和體內(nèi)治療卵巢癌:
[0029]在體外，發(fā)明人用MTT法檢測(cè)VSVMP/DPP復(fù)合物對(duì)SK0V3卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSVMP/DPP復(fù)合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用DPP納米粒介導(dǎo)VSVMP基因質(zhì)粒進(jìn)入SK0V3卵巢癌細(xì)胞中，DPP/VSVMP復(fù)合物通過(guò)誘導(dǎo)凋亡可以明顯抑制SK0V3細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0030]在體內(nèi)，發(fā)明人建立人卵巢癌裸鼠腹腔種植瘤模型，比較各組裸鼠腹腔腫瘤結(jié)節(jié)的重量和數(shù)目，以及腹水產(chǎn)生的差異。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)DPP/VSVMP復(fù)合物可以顯著地減少小鼠腫瘤的負(fù)荷和腹水的產(chǎn)生。體外體內(nèi)治療數(shù)據(jù)表明，DPP納米粒傳遞VSVMP基因可以在體外和體內(nèi)有效抑制人卵巢癌腫瘤細(xì)胞SK0V3的生長(zhǎng)。
[0031]本發(fā)明通過(guò)自組裝法制備出了一種新型的可降解陽(yáng)離子納米粒:DOTAP-mPEG-PLA,該納米粒可通過(guò)靜電相互作用結(jié)合DNA，可有效地將基因?qū)氲侥[瘤細(xì)胞中，具有基因轉(zhuǎn)染率高、細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)，在基因?qū)胫杏兄匾膽?yīng)用，在基因功能研究、基因治療研究及臨床應(yīng)用中有很好的應(yīng)用前景。DOTAP-mPEG-PLA納米?？山閷?dǎo)基因等活性成分發(fā)揮療效，如DOTAP-mPEG-PLA納米粒介導(dǎo)VSVMP基因可以在體外和體內(nèi)有效抑制人卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。DPP納米粒是一種相對(duì)安全的可降解性非病毒基因載體，制備所得VSVMP/DPP復(fù)合物為治療卵巢癌提供了一種新的思路和潛在的選擇。
【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1 (A) mPEG-PLA的分子結(jié)構(gòu)式；(B) D0TAP的分子結(jié)構(gòu)式。
[0033]圖2 DPP納米粒的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0034]圖3 DPP納米粒的粒徑及電位分布圖:(A) DPP納米粒的粒徑分布圖；(B) DPP納米粒的電位分布圖。
[0035]圖4 DPP納米粒