葉酸修飾的硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物及其合成方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種納米聚合物自組裝膠束材料及其應(yīng)用，具體涉及一種葉酸修飾的硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物及其合成方法與應(yīng)用，屬于生物醫(yī)用材料和納米藥物制劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，腫瘤的發(fā)生率和死亡率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，具有死亡率高、預(yù)后性差的特點。目前，化學(xué)療法仍然是腫瘤治療的主要方法之一，臨床上常用的化療藥物以細胞毒性型藥物為主，故藥物在通過全身給藥方式獲得治療效果的同時對人體正常的臟器也存在著較強的細胞毒性，繼而引發(fā)嚴(yán)重的毒副作用。因此開發(fā)合適的制劑以提高難溶性化療藥物的溶解度，增加其靶向治療以降低化學(xué)療法帶來的潛在危險是目前藥物劑型開發(fā)和遞送領(lǐng)域的研究熱點。
[0003]聚合物膠束作為藥物載體發(fā)展于20世紀(jì)90年代，是由兩親性的高分子聚合物在水中通過疏水基團的分子內(nèi)和分子間作用力自發(fā)形成的一種具有典型核殼結(jié)構(gòu)的自組裝結(jié)構(gòu)。該膠束系統(tǒng)由緊密的疏水內(nèi)核和親水性的外殼組成，難溶性藥物可以通過疏水作用力包載于內(nèi)核中。作為低毒、高穩(wěn)定性的納米載藥系統(tǒng)，聚合物膠束系統(tǒng)可有效地改善難溶性藥物的溶解性，延長藥物在血液中的循環(huán)時間，改變藥物的體內(nèi)分布，提高藥物生物利用度，并且具有一定的被動靶向性。這些優(yōu)點可以有效降低化療過程中的非特異性不良反應(yīng)，提高治療效能，尤為適用于腫瘤的治療。然而，這些納米給藥系統(tǒng)不能有效地從網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)逃逸，且在體內(nèi)很容易被單核巨噬細胞吞噬而清除。另一方面，這種依賴制劑納米級粒徑實現(xiàn)的被動靶向依然無法實現(xiàn)腫瘤部位充分攝取、易引發(fā)系統(tǒng)毒副反應(yīng)甚至多藥耐藥從而降低療效的現(xiàn)象。為了完成腫瘤納米系統(tǒng)的靶向給藥，利用體內(nèi)的特異性分子識別機制，采用靶向納米載體或在納米載體表面偶聯(lián)靶標(biāo)分子已成為一種較為成熟的靶向策略。
[0004]硫酸軟骨素是一種硫酸化的線性粘多聚糖，是由糖苷鍵鏈接葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖構(gòu)成的二糖單元重復(fù)而成。硫酸軟骨素廣泛分布于動物組織中，主要存在于皮膚、血管、心臟瓣膜和肌腱部分，平均分子量約為2X104道爾頓。具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗凝血等多種生理活性。廣泛應(yīng)用于骨骼相關(guān)疾病、腦損傷復(fù)合等疾病的治療。硫酸軟骨素具有優(yōu)良的水溶性，同時骨架中含有大量活潑的可修飾的游離基團，能夠通過化學(xué)修飾賦予其新的性能。因此對以硫酸軟骨素為親水性基本骨架構(gòu)架納米給藥系統(tǒng)的研究日益增多。此外，許多腫瘤細胞表面高表達CD44受體，除與透明質(zhì)酸結(jié)合外，相關(guān)研究報道CD44也可特異性識別并結(jié)合硫酸軟骨素。因此，期望以硫酸軟骨素為骨架的納米載體系統(tǒng)用以治療過表達CD44受體的腫瘤細胞，達到提高藥效、革E向治療的目的。
[0005]脫氧膽酸(D0CA)是目前常用的疏水性改性修飾劑，其分子中既含有碳原子側(cè)鏈末端的羧基及3、12位的羧基這類親水基，也包含環(huán)戊烯菲這種疏水基。因此，期望通過化學(xué)手段將疏水性小分子D0CA引入硫酸軟骨素骨架中從而構(gòu)建兩親性聚合物并誘使其在水性介質(zhì)中發(fā)生自組裝聚合成為具有疏水內(nèi)核的核殼結(jié)構(gòu)膠束。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)公開葉酸是一種小分子維生素，分子結(jié)構(gòu)中含有喋呤環(huán)，需經(jīng)內(nèi)化才能被人體吸收。研究報道葉酸兩種內(nèi)化機制:一是低親和力的跨膜蛋白，轉(zhuǎn)運四氫葉酸、二氫葉酸進入細胞內(nèi)；二是高親和力的葉酸受體，可特異性高效吸收葉酸進入細胞內(nèi)。葉酸受體是一種糖蛋白膜受體，高度表達于某些實體瘤細胞膜表面，而在正常組織低表達。葉酸受體可特異性識別并結(jié)合葉酸或葉酸偶聯(lián)物，且具有高親和性、選擇性、飽和性和生物效應(yīng)明顯等優(yōu)點。因此，將葉酸連接到聚合物膠束表面獲得靶向癌細胞遞送的特性，可以提高藥物在病灶部位的濃度，提高療效，降低毒副反應(yīng)，達到靶向治療的目的。
[0007]將硫酸軟骨素、脫氧膽酸和葉酸相結(jié)合構(gòu)建復(fù)合聚合物，并將其用于腫瘤的診斷和治療具有很大的研究開發(fā)前景。但該設(shè)計尚未見相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種葉酸修飾的硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物及其合成方法。以硫酸軟骨素作為水溶性骨架材料構(gòu)建聚合物膠束，在硫酸軟骨素分子上引入脫氧膽酸進行疏水改性，使其具備在水性溶液中自組裝聚集的性能。通過聚合物表面葉酸的修飾，利用葉酸與葉酸受體、硫酸軟骨素與CD44特異性結(jié)合，實現(xiàn)聚合物膠束對相關(guān)受體高表達的腫瘤組織的雙靶向特性，實現(xiàn)納米膠束的腫瘤細胞靶向藥物遞送。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供該聚合物作為生物可降解性材料用于制備抗腫瘤藥物肝靶向納米制劑的應(yīng)用。
[〇〇1〇]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0011]—種葉酸修飾的硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物，是由硫酸軟骨素接枝己二酸二酰肼后，與活化后的脫氧膽酸按質(zhì)量比為1:〇.3-0.8反應(yīng)，構(gòu)建得到硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物，經(jīng)葉酸修飾后制備而成的具有CD44和葉酸受體雙靶向的聚合物膠束。
[0012]上述枝接己二酸二酰肼后的硫酸軟骨素，其中己二酸二酰肼取代度范圍為14-18%〇
[0013]上述硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物中，脫氧膽酸的取代度范圍為4% -9%。
[0014]該葉酸修飾的硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物的合成方法，步驟為:
[0015]將硫酸軟骨素、己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺按質(zhì)量比(0.3-0.4):(5-7):(1-1.2):(0.1-0.2)反應(yīng)，制備得到硫酸軟骨素-己二酸二酰肼；然后與活化后的脫氧膽酸按質(zhì)量比1: (0.3-0.8)反應(yīng)，制備得到硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物；向硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物中按質(zhì)量比1: (〇.4-0.5)加入活化后的葉酸進行修飾，即得到葉酸修飾的硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物。
[0016]所述脫氧膽酸的活化方法為:將脫氧膽酸溶解于N，N_二甲基甲酰胺，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫活化，調(diào)節(jié)PH7-9 ;脫氧膽酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為 1: (1.5-2.5): (1.5-2.5)。
[0017]所述葉酸的活化方法為:將葉酸溶解于二甲亞砜溶液，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺，調(diào)節(jié)pH7-9,室溫活化2-6小時；葉酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1:(1.5-2.5): (1.5-2.5)。
[0018]該葉酸修飾的硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物的合成方法，具體步驟如下:
[0019](1)硫酸軟骨素-己二酸二酰肼的合成:將硫酸軟骨素溶解于蒸餾水中，充分溶解后向其中依次加入己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH至6-7，室溫攪拌反應(yīng)20-30小時，得硫酸軟骨素-己二酸二酰肼；
[0020](2)脫氧膽酸的活化:將脫氧膽酸溶解于N，N_ 二甲基甲酰胺，向其中依次加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺，室溫活化30分鐘，然后加入3-5滴有機堿調(diào)節(jié)pH7-9。
[0021](3)硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物的合成:將步驟⑴中所得的硫酸軟骨素-己二酸二酰肼溶于蒸餾水中，攪拌使其充分溶脹、溶解，然后加入等倍體積N，N 二甲基甲酰胺稀釋，備用；將活化的脫氧膽酸溶液在強烈攪拌下滴入上述硫酸軟骨素-己二酸二酰肼溶液中，室溫攪拌反應(yīng)40-50小時，得到反應(yīng)物溶液，反應(yīng)溶液經(jīng)純化、冷凍干燥即得硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物。
[0022](4)葉酸的活化:將葉酸溶解于二甲亞砜溶液，向其中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺，加適量三乙胺調(diào)節(jié)pH7-9，室溫活化2-6小時，使葉酸充分溶解。
[0023](5)葉酸修飾的硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物的合成:將步驟(3)中所得的硫酸軟骨素-脫氧膽酸溶于蒸餾水中，攪拌使其充分溶脹、溶解，然后加入二倍體積二甲亞砜稀釋，備用；將活化的葉酸溶液在強烈攪拌下滴入上述硫酸軟骨素-脫氧膽酸溶液中，室溫攪拌反應(yīng)40-50小時，得到反應(yīng)物溶液，反應(yīng)溶液經(jīng)純化、冷凍干燥即得葉酸修飾的硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物。
[0024]步驟⑴中，所述硫酸軟骨素、蒸餾水、己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為(0.3-0.4): 100:(5-7):(1-1.2):(0.1-0.2)。硫酸軟骨素的分子量為10kD。硫酸軟骨素-己二酸二酰肼的己二酸二酰肼取代度為14-18% (優(yōu)選為16% )。
[0025]本發(fā)明將硫酸軟骨素接枝己二酸二酰肼之后，引入末端氨基，該氨基與脫氧膽酸的羧基發(fā)生酰胺反應(yīng)，由此構(gòu)建硫酸軟骨素-脫氧膽酸聚合物，這種合成方法可以提高反應(yīng)活性，獲得較為理想的脫氧膽酸取代度。
[0026]步驟(2)中，脫氧膽酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、有機堿的摩爾比為1:(1.5-2.5):(1.5-2.5):(1.5-2.5)，優(yōu)選為1 '2:2:2 ；N, N二甲