骨髓單個(gè)核細(xì)胞亞群的分選及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新的細(xì)胞亞群在治療心肌梗死病變過(guò)程中的作用，屬于生物醫(yī) 藥，細(xì)胞生物學(xué)，心血管領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 心肌梗死是由冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。我國(guó)近年來(lái)發(fā) 病呈上升趨勢(shì)，每年新發(fā)約50萬(wàn)例，現(xiàn)患至少200萬(wàn)。心肌梗死原于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo) 致的血管閉塞。當(dāng)心肌缺血缺氧達(dá)到失代償時(shí)出現(xiàn)癥狀。心梗一旦發(fā)生，心肌細(xì)胞絕對(duì)數(shù) 量減少并不可再生，心臟栗血能力降低，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致心律失常，休克甚至心力衰竭直至死 亡。目前臨床上對(duì)于心肌梗死的治療主要針對(duì)的是解除冠狀動(dòng)脈血管阻塞，增加心肌血流 灌注來(lái)改善心肌缺血缺氧。但是對(duì)于已壞死的心肌細(xì)胞和既有發(fā)生的心室重構(gòu)目前臨床治 療還無(wú)法逆轉(zhuǎn)。研究表明，骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植的方法能在一定程度上減輕心肌梗死后的 心室重構(gòu)和心臟射血能力的下降，甚至有可能在一定程度上恢復(fù)死亡的心肌細(xì)胞，因此，此 種療法對(duì)目前的臨床治療有著極強(qiáng)的補(bǔ)充作用，故發(fā)展前景十分廣闊。但是骨髓單個(gè)核細(xì) 胞成分十分復(fù)雜，具體發(fā)揮保護(hù)心臟功能的細(xì)胞亞群目前尚不明確。
[0003] ⑶117干細(xì)胞因子受體是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，廣泛分布于造血干 細(xì)胞群中，是造血干細(xì)胞的一種重要的表面標(biāo)記。研究表明許多骨髓來(lái)源干細(xì)胞都表達(dá) ⑶117,并且⑶117 +的骨髓來(lái)源干細(xì)胞因其良好的可擴(kuò)增性及可塑性而被廣泛用于治療心 肌梗死的研究中。但是，目前移植細(xì)胞的低歸巢率以及低成活率等問(wèn)題一直困擾著CD117+ 骨髓干細(xì)胞的應(yīng)用。
[0004] RAS系統(tǒng)被認(rèn)為在心肌梗死后對(duì)心血管結(jié)構(gòu)的重塑，電解質(zhì)的調(diào)節(jié)以及炎癥反應(yīng) 的發(fā)展有著重要的作用。早在19世紀(jì)就發(fā)現(xiàn)了RAS，它的基本作用是調(diào)節(jié)血壓以及保持電 解質(zhì)和體液的平衡。RAS存在兩種形式：循環(huán)系統(tǒng)中的RAS和局部的RAS。許多組織如心 臟，大腦等都存在局部組織的RAS，大多病理狀態(tài)主要激活的是局部RAS，局部RAS激活后會(huì) 促進(jìn)和加強(qiáng)既有疾病的病理進(jìn)程。血管緊張素II(ANGII)是RAS發(fā)揮作用最重要的因素， ANGII主要作用于這兩種受體。41\1?大量分布在成熟組織中，并且ANGII絕 大部分生理作用如血管收縮、水鈉吸收等是通過(guò)41\1?實(shí)現(xiàn)的。AT2R又叫做血管及張素II2 型受體，它是一個(gè)由363個(gè)氨基酸編碼組成，分子量為41kDa的受體蛋白，其基因位于染色 體Xq22-23，它與AI\R同屬于七次跨膜蛋白并且兩者有34 %的氨基酸序列相同。AT2R在胚 胎組織中表達(dá)量較高，但在出生后明顯下降，最終局限并低表達(dá)于心臟、腦、腎臟等器官。在 病理狀態(tài)下如炎癥反應(yīng)、心肌缺血、血管損傷等，AT2R會(huì)重新大量表達(dá)，并且這種表達(dá)不受 年齡的限制。已有文獻(xiàn)指出，刺激AT2R對(duì)于心臟，腦或者腎臟的急性缺血性損傷具有保護(hù) 作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種可應(yīng)用于治療心肌梗死病變的基于血管緊張素II受體 2型及骨髓干細(xì)胞CD117的新的細(xì)胞亞群的分選和應(yīng)用。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] ⑶117+AT2R+骨髓單個(gè)核細(xì)胞亞群在制備治療心肌梗死病變的藥物中的應(yīng)用。
[0008] ⑶117+AT2R+骨髓單個(gè)核細(xì)胞亞群（BMMNCs)的分選方法，其特征在于，包括：收集 骨髓，采用密度梯度離心法分離得到骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用PBS洗滌，離心后封閉，加入AT2R 抗體并孵育，PBS洗滌后，加入熒光二抗以及⑶117-PE流式抗體，孵育后PBS洗滌，重懸后 上機(jī)，用流式分選儀分別收集⑶117+AT2R+細(xì)胞亞群以及⑶117 +AT2R細(xì)胞亞群。
[0009] 優(yōu)選地，所述的骨髓為小鼠的骨髓。
[0010] 優(yōu)選地，所述的骨髓為健康人或心臟病人的骨髓。
[0011] 更優(yōu)選地，所述的心臟病人為心肌梗死病人。
[0012] ⑶117+AT2R+骨髓單個(gè)核細(xì)胞亞群的鑒定方法，其特征在于，包括：利用流式細(xì)胞 分析技術(shù)手段鑒定表面標(biāo)志物CD117+AT2R+為陽(yáng)性的細(xì)胞，分選下來(lái)的細(xì)胞重懸，然后利用 流式分析儀分析所獲得細(xì)胞的純度。
[0013] 本發(fā)明采用流式細(xì)胞分析和分選的方法，分析骨髓單個(gè)核細(xì)胞中AT2R以 及⑶117+AT2R+細(xì)胞亞群的含量，并從骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分選出⑶117 +AT2R+細(xì)胞與 CD117+AT2R-細(xì)胞。將分選獲得的兩群細(xì)胞連同未分選的BMMNCs與大乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)， 然后提取RNA，RT-PCR方法檢測(cè)Gata4和Nkx2. 5的表達(dá)情況。將這兩群細(xì)胞連同未分選的 BMMNCs共三群細(xì)胞提取RNA，RT-PCR方法檢測(cè)AT2R表達(dá)情況；qRT-PCR方法檢測(cè)干性轉(zhuǎn)錄 因子Rex-1，Nanog和 0CT-4 的表達(dá)。將分選獲得的CD117+AT2R+,CD117+AT2RBMMNCs連同 未分選的BMMNC分別與H9C2心肌細(xì)胞在無(wú)血清缺氧的條件共培養(yǎng)。將共培養(yǎng)后利用流式 凋亡試劑盒，按說(shuō)明書(shū)方法對(duì)H9C2細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀測(cè)定H9C2細(xì)胞的凋亡情況。 將分選獲得的兩群細(xì)胞連同未分選的BMMNCs，利用transwell迀移檢測(cè)體系（8μm)，測(cè)定 24h不同細(xì)胞亞群的迀移數(shù)量。將分選獲得的⑶117+AT2R+，⑶117+AT2RBMMNCs連同未分選 的BMMNCs，分別從心梗小鼠尾靜脈注入到體內(nèi)，三周后使用心臟超聲觀(guān)察心功能的變化。
[0014] 目前發(fā)現(xiàn)心臟原位的⑶117+AT2R+細(xì)胞亞群在心肌缺血應(yīng)激后數(shù)量明顯增多，并 且此群細(xì)胞高表達(dá)GATA4，NKX2. 5等心肌表型。但這群細(xì)胞的來(lái)源未能明確。因此，我們猜 想當(dāng)心梗發(fā)生后，缺血損傷應(yīng)激可動(dòng)員機(jī)體內(nèi)⑶117+AT2R+骨髓干細(xì)胞亞群向受損心肌迀 移并參與損傷修復(fù)。本發(fā)明對(duì)骨髓中CD117+AT2R+干細(xì)胞亞群進(jìn)行了研究，首次論證了心肌 梗死后，骨髓中⑶117+AT2R+的骨髓單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)上調(diào)。并首次將⑶117 +AT2R+骨髓單個(gè) 核細(xì)胞分選出來(lái)，并在體外和體內(nèi)闡述其與心肌梗死修復(fù)有關(guān)的一系列特性。CD117+AT2R+ 細(xì)胞的干性基因Rex-1，0CT-4以及Nanog表達(dá)量高于⑶117+AT2R細(xì)胞，證明⑶117 +AT2R+ 細(xì)胞亞群具有更強(qiáng)的可塑性。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0016] 本發(fā)明通過(guò)將⑶117+AT2R+骨髓單個(gè)核細(xì)胞亞群從患有心肌梗死的小鼠骨髓中分 離出來(lái)，進(jìn)而通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)其迀移，凋亡，以及心臟保護(hù)等能力首次進(jìn)行闡述。本 發(fā)明首先闡明了⑶117 +AT2R+BMMNCs在假手術(shù)組和心肌梗死組骨髓中的表達(dá)差異，首先提 出發(fā)揮治療作用的主要是⑶117+AT2R+BMMNCs亞群。通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，該亞群細(xì)胞 具有較強(qiáng)的迀移和侵襲能力，并且減輕心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)量，以及分化成心肌細(xì)胞的潛在 能力，在體內(nèi)具有優(yōu)于CD117+AT2R骨髓單個(gè)核細(xì)胞亞群改善心肌梗死小鼠心臟功能的作 用，從而證明⑶117+AT2R+BMMNCs亞群具有更優(yōu)的治療心肌梗死的療效。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1A為流式細(xì)胞分析結(jié)果圖，顯示心肌梗死后小鼠骨髓中⑶117+AT2R+細(xì)胞數(shù)目 明顯上升。
[0018] 圖 1B為統(tǒng)計(jì)比較AT2R,Sca-1+AT2R+,CD34+AT2R+以及CD117+AT2R+細(xì)胞亞群在心肌 梗死前后的變化圖。
[0019] 圖1C為RT-PCR結(jié)果圖，顯示心肌梗死后小鼠骨髓中AT2R表達(dá)量上升。
[0020] 圖2為分別心肌細(xì)胞共培養(yǎng)7天，14天后，Gata4,Nkx2. 5表達(dá)水平圖，與其他組相 比，心肌早起分化標(biāo)記物Gata4,Nkx2. 5在⑶117+AT2R+細(xì)胞中的表達(dá)較高。
[0021] 圖 3 為Rex-l，0CT-4、Nanog表達(dá)水平圖，與CD117+AT2R細(xì)胞相比，CD117 +AT2R+細(xì) 胞的干性基因Rex-1，OCT-4、Nanog等表達(dá)較高。
[0022] 圖4為細(xì)胞凋亡結(jié)果圖，與對(duì)照組相比，⑶117+AT2R+細(xì)胞可使心肌細(xì)胞H9C2凋亡 量減少，而CD117+AT2R細(xì)胞抑制凋亡的效果不如CD117 +AT2R+細(xì)胞理想。
[0023] 圖5為體外迀移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，⑶117+AT2R+細(xì)胞的迀移能力明顯強(qiáng)于 CD117+AT2R細(xì)胞。
[0024] 圖6A為心臟超聲圖，圖6B為心臟射血分?jǐn)?shù)圖，⑶117+AT2R+與⑶117 +AT2RBMMNCs 移植3周后心臟超聲檢測(cè)心臟射血分?jǐn)?shù)（EF)顯示，⑶117+AT2R+BMMNCs對(duì)心臟射血的保護(hù) 作用明顯強(qiáng)于CD117+AT2RBMMNCs亞群。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。
[0026] 實(shí)施例1 :探究⑶117+AT2R+BMMNCs亞群在心肌梗死病變過(guò)程中的作用
[0027] 1.心肌梗死模型的制作：
[0028] 心肌梗死組小鼠處理方法：在無(wú)菌環(huán)境下將C57BL/6小鼠用1. 5 %的異氟烷氣體 麻醉，用脫毛膏將胸前的毛發(fā)脫去并用酒精棉球消毒皮膚。將第四肋間皮膚剪破，鈍性分離 肌肉，然后用止血鉗撐開(kāi)肋骨，同時(shí)擠出心臟。用6-0縫合線(xiàn)在左心耳下2_處結(jié)扎冠狀動(dòng) 脈左前降支。完成后將心臟送回胸腔，排凈空氣，得到心肌梗死組小鼠。
[0029] 假手術(shù)組小鼠處理方法：與心肌梗死組小鼠處理方法區(qū)別在于只將心臟擠出而不 結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，其他與心肌梗死組操作步驟相同。
[0030] 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌梗死小鼠骨髓中AT2R的表達(dá)變化及細(xì)胞亞群定位：
[0031] 分別收集假手術(shù)組和心肌梗死組小鼠的骨髓，用ficoll(達(dá)科為）分離液，采用密 度梯度離心法（400g，30分鐘）分離得到骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，每次五分鐘， 離心后再用1%BSA(Sigma，A1933,美國(guó)）封閉15分鐘，重懸于Stainingbuffer(0. 02% EDTA:1%BSA= 1:1)后按體積比1:100的比例加入兔抗鼠AT2R抗體（abeam，abl9132， 英國(guó)）4°C孵育30mins，PBS洗滌后按體積比1:1000的比例加入抗兔647熒光二抗（life technology，A-31573,美國(guó)）以及分別按體積比1:100的比例加入抗鼠⑶117-PE流式抗體 (BD，美國(guó)）、抗鼠CD34-PE流式抗體（BD，美國(guó)）和抗鼠Sca-1-FITC流式抗體（BD，美國(guó)）， 4°C避光孵育30mins后PBS洗滌。重懸后上機(jī)，用流式分選儀（BDFACSArial，美國(guó)）分別 收集⑶117+AT2R+細(xì)胞亞群以及⑶117 +AT2R-細(xì)胞亞群，整個(gè)分選過(guò)程控制在3個(gè)小時(shí)以?xún)?nèi)。
[0032] 流式細(xì)胞分析結(jié)果如圖1A所示，與假手術(shù)組相比（圖1A)，心肌梗死小鼠外骨髓中 AT2R表達(dá)明顯上升，如圖 1B所示，比較AT2R,Sca-1+AT2R+,CD34+AT2R+以及CD117 +AT2R+細(xì) 胞亞群在心肌梗死前后的變化，AT2R與⑶117+骨髓細(xì)胞共表達(dá)量上升最明顯。
[0033] 3.RT-PCR方法檢測(cè)AT2R表達(dá)量：
[0034] 將步驟2中分離得到的假手術(shù)組和心肌梗死組小鼠的骨髓單個(gè)核