一種利用脊髓灰質(zhì)炎減毒株生產(chǎn)的滅活疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品制備領(lǐng)域，具體地，涉及一種利用脊髓灰質(zhì)炎減毒株Sabin 株生產(chǎn)的滅活疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 脊髓灰質(zhì)炎病毒屬于小RNA病毒科（Picornaviridae)腸道病毒屬 (Enterovirus)，內(nèi)含單股正鏈RNA基因，蛋白衣殼為二十面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無包膜。脊髓 灰質(zhì)炎病毒有3種血清型，分別為I、II和III型。脊髓灰質(zhì)炎病毒顆粒包括實(shí)心結(jié)構(gòu)病毒顆 粒和空心結(jié)構(gòu)病毒顆粒，其中實(shí)心結(jié)構(gòu)病毒顆粒能與機(jī)體細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生中和抗體。脊髓灰 質(zhì)炎是由脊髓灰質(zhì)炎病毒引起的具有很強(qiáng)傳染力的疾病，主要感染五歲以下的兒童。1/200 的患者會(huì)產(chǎn)生不可逆的腿部癱瘓，更嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致吞咽和說話的困難。有5% -10%的患者 因?yàn)楹粑÷楸詫?dǎo)致死亡。目前尚無治療脊灰的有效手段，脊髓灰質(zhì)炎疫苗的接種是最有 效的預(yù)防該疾病發(fā)生和傳染的方法。
[0003]目前上市的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗有減毒疫苗（0PV)和滅活疫苗（IPV)。0PV是多 數(shù)國(guó)家計(jì)劃免疫中的主要疫苗品種之一。1985年至2003年有超過5. 5億兒童在94個(gè)國(guó)家 已經(jīng)接種了 0PV疫苗。雖然0PV免疫力強(qiáng)、作用時(shí)間長(zhǎng)，免疫劑量少，免疫程序簡(jiǎn)單，為消除 脊灰發(fā)揮了重要作用，但0PV的接種引起的脊灰疫苗相關(guān)病例（VAPP)和脊髓灰質(zhì)炎疫苗衍 生株（VDPV)威脅始終存在，甚至成為影響公眾健康、社會(huì)穩(wěn)定的問題。由于0PV是一種減 毒活疫苗，必然存在一定的安全問題。首先，減毒的脊灰病毒一旦毒力返祖，可直接導(dǎo)致脊 髓灰質(zhì)炎相關(guān)疾??；其次，疫苗株經(jīng)循環(huán)形成的衍生株也可引發(fā)相關(guān)病例；此外，極少部分 免疫缺陷的接種者使用減毒活疫苗后會(huì)成為衍生脊灰病毒的攜帶者，他們會(huì)長(zhǎng)期排出病毒 導(dǎo)致疾病傳播。相對(duì)而言，IPV的使用則可以徹底消除減毒活疫苗引起的病毒感染以及由 疫苗衍生脊灰病毒造成的疾病爆發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。為了徹底消除脊灰，WHO制定了全球消除脊灰行 動(dòng)計(jì)劃，預(yù)計(jì)到2015年消除脊灰野病毒并在2018年認(rèn)證全球無脊灰狀態(tài)。在此過程中，將 逐步使用IPV和sIPV代替0PV。
[0004]IPV使用野毒株salk株作為生產(chǎn)原料，對(duì)生物安全等級(jí)要求嚴(yán)格，因此生產(chǎn)商的 數(shù)量十分有限；此外，由于IPV的價(jià)格相對(duì)高昂，主要用于發(fā)達(dá)國(guó)家的計(jì)劃免疫和發(fā)展中國(guó) 家的私人市場(chǎng)。
[0005]WHO推薦發(fā)展中國(guó)家在消滅脊灰最后階段使用一種由減毒株（Sabin株）生產(chǎn)的新 型滅活脊灰疫苗來代替0PV疫苗的使用，從而徹底消除因接種該疫苗導(dǎo)致的VDPV和VAPP 的發(fā)生。這在消滅脊灰的最后階段并全面使用滅活疫苗的背景下，具有重要的補(bǔ)充意義： 使用減毒株生產(chǎn)的Sabin-IPV，較使用野毒株（Salk株）生產(chǎn)的IPV滅活疫苗，具有生產(chǎn)更 安全、成本更低廉的特點(diǎn)，更適合在發(fā)展中國(guó)家推廣使用。目前，對(duì)脊灰野毒株Salk株的管 理極為嚴(yán)格，在中國(guó)境內(nèi)不允許使用野毒株來生產(chǎn)IPV，選擇利用生產(chǎn)0PV用的脊灰減毒株 Sabin株研制滅活疫苗，即Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（sIPV)，是全球消除脊灰的重要途 徑。
[0006] 傳統(tǒng)的sIPV疫苗純化工藝通常包括超濾濃縮、離子交換層析、除菌過濾等步驟。 離子交換層析的分離方法在SIPV疫苗純化工藝中成本比較高，且無法有效地將實(shí)心病毒 顆粒與空心病毒顆粒分離。此外，由于實(shí)心病毒能與機(jī)體細(xì)胞反應(yīng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗 體，并經(jīng)大鼠體內(nèi)免疫原性試驗(yàn)證實(shí)：實(shí)心病毒顆粒產(chǎn)生的中和抗體至少是空心病毒顆粒 的10倍。另外，sIPV生產(chǎn)使用的減毒株Sabin株與IPV生產(chǎn)使用的野毒株Salk株有本質(zhì) 上的區(qū)別，比如病毒的基因序列、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性等均不相同，由于傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝不適應(yīng) sIPV的生產(chǎn)導(dǎo)致疫苗產(chǎn)率較低。因此，亟待需要一種利用減毒株Sabin株生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎 滅活疫苗新的方法，能夠有效分離脊髓灰質(zhì)炎病毒液中的實(shí)心病毒顆粒與空心病毒顆粒， 而且有效地去除了雜質(zhì)蛋白，大大提高了離心產(chǎn)物中實(shí)心病毒顆粒的含量，使利用該病毒 液制備得到的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗免疫原性良好、有效滴度高、雜質(zhì)含量低、安全性和穩(wěn)定 性尚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種免疫原性良好、有效滴度高、雜質(zhì)含量低、安全性和穩(wěn) 定性高的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗。
[0008] 本發(fā)明提供的脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗是利用減毒株Sabin株制備得到。
[0009] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的滅活疫苗是將減毒株Sabin株I型、II型、III型的單價(jià)病毒 純化液滅活后混合，添加保護(hù)劑制備得到。
[0010] 本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗中減毒株Sabin株I型、II型、III型的抗原含 量分別為 7-25DU、25-68DU、25-68DU。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗中減毒株Sabin株I型、II型、III型 的抗原含量分別為12-18DU、36-54DU、36-54DU。
[0012] 更優(yōu)選地，本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗中減毒株Sabin株I型、II型、III 型的抗原含量分別為15DU、4?U、45DU。
[0013] 上述減毒株Sabin株I型、II型、III型的單價(jià)病毒純化液通過以下方法制備得 到：
[0014] (1)分別將Sabin株I型、II型、III型病毒液超濾濃縮；
[0015] (2)蔗糖密度梯度離心；
[0016] (3)收集合并離心液。
[0017] 其中，步驟（1)的病毒液超濾濃縮是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的：
[0018] 1)澄清將病毒液經(jīng)連續(xù)3級(jí)孔徑為3-0. 8μm、0. 8-0. 65μm、0. 65-0. 22μm的濾 芯過濾或離心（包括連續(xù)流離心）轉(zhuǎn)速為2000-500()rpm，離心時(shí)間為0. 5-4個(gè)小時(shí)，得到病 毒澄清液；
[0019] 2)濃縮病毒澄清液經(jīng)切向流膜過濾或中空纖維過濾濃縮，濃縮倍數(shù)為50-200 倍，使用截留分子量為100萬-500萬。
[0020] 其中，步驟（2)的密度梯度離心方法為：
[0021] 依次從離心機(jī)邊孔以50~lOOrpm依次栗入超離緩沖液，病毒超濾濃縮液，低 濃度蔗糖溶液，最后以50~150rpm栗入高濃度蔗糖溶液直至中孔流出液體離心轉(zhuǎn)速為 28000~35000rpm，離心時(shí)間為：6~20小時(shí)，離心溫度為2~8°C。
[0022] 超離緩沖液與病毒超濾濃縮液的體積比為1:5~1 :10 ;病毒超濾濃縮液與低濃度 蔗糖溶液的體積比為1 :1~2:1 ;高濃度蔗糖加入標(biāo)準(zhǔn)為只要離心機(jī)中空流出液體即可停 止加入高濃度蔗糖。
[0023] 其中，所述低濃度蔗糖質(zhì)量百分比為25%~45%，高濃度蔗糖質(zhì)量百分比為 55%~60%〇
[0024] 其中，超離緩沖液選自0. 1~0. 5M的PB、PBS和PBST中的一種。
[0025] 進(jìn)一步地，步驟（2)的密度梯度離心方法中，純化脊髓灰質(zhì)炎病毒液時(shí)，當(dāng)脊髓灰 質(zhì)炎病毒液為Sabin株脊髓灰質(zhì)炎病毒I、II時(shí)，超離緩沖液的pH值為：6. 0~7. 0 ;當(dāng)脊髓 灰質(zhì)炎病毒液為Sabin株脊髓灰質(zhì)炎病毒III型時(shí)，超離心緩沖液的pH值為：6. 5~7. 5。
[0026] 本發(fā)明方法的步驟（3)中，根據(jù)不同性質(zhì)的病毒顆粒沉降系數(shù)不同，導(dǎo)致其處于 不同糖度位置，進(jìn)而分離不同的超離液，即收集并合并處于相同位置的離心液。其中超離液 1(含實(shí)心病毒）主要位于糖度54 %，超離液2 (含空心病毒和少量實(shí)心病毒）為50 %-54 % 的糖度位置。
[0027] 上述步驟（3)中，收集離心液后，還包括采用離子交換層析方法對(duì)離心液進(jìn)行純 化，具體為：使用DEAES印haroseFastFlow，分別檢測(cè)I、II、III型病毒顆粒的260/280 或254/280值，收集流穿峰。離子交換的pH值根據(jù)病毒型別穩(wěn)定性的差異，選擇范圍為 pH6. 5-7. 5。平衡緩沖液和樣品的電導(dǎo)率控制在15-45ms/cm范圍內(nèi)。
[0028] 本發(fā)明通過對(duì)sIPV的傳統(tǒng)純化工藝進(jìn)行了改進(jìn)，將原有的離子交換層析工藝步 驟替換為密度梯度離心（或者連續(xù)流密度梯度離心）工藝，有效地將實(shí)心病毒顆粒與空心 病毒顆粒分離，不僅提高了單位劑量sIPV病毒液的免疫原性，而且大大降低了以此病毒液 制備得到的疫苗使用后的副反應(yīng)，同時(shí)降低了