35mg，lmmol)20ml的甲醇（溶劑甲醇的濃度為60v/v% )溶 液，滴加到含有l(wèi)mmol2-苯甲酰基吡啶縮氨基硫脲配體的20ml乙醇（溶劑乙醇的濃度為 50v/v% )溶液中，于60°C回流攪拌2h，將反應(yīng)后溶液過濾到50ml燒杯中，并用保鮮膜封 口，針扎20個孔于4°C揮發(fā)數(shù)日，得到深棕色晶體。
[0046] 將所得的深棕色晶體進(jìn)行紅外光譜和單晶衍射分析，具體波譜特性如下：
[0047] (1)紅外光譜，其譜圖如圖1所示；
[0048] (2)X射線單晶衍射分析，確定其單晶結(jié)構(gòu)圖如圖2所示。
[0049] 因此，可以確定所得的深棕色固體產(chǎn)物為以2-苯甲?；拎たs氨基硫脲為配體 的銅（II)金屬配合物，其結(jié)構(gòu)式如下式（I)所示：
[0050]
[0051] 實施例2:BpT配合物的合成
[0052] a)將lOmmol的2-苯甲?；鵕比啶溶解于10ml的甲醇（溶劑甲醇的濃度為80v/ v% )中，于50°C攪拌15min，制得溶液，將上述溶液逐滴滴入20ml加有l(wèi)Ommol氨基硫脲的 乙醇（溶劑乙醇的濃度為20v/v% )溶液中，于80°C回流攪拌反應(yīng)18h得淡黃色沉淀物，將 上述所得淡黃色沉淀過濾后用水洗3次，干燥后，得配體2-苯甲酰基吡啶縮氨基硫脲；
[0053] b)將含有CuBr2 (223. 35mg，lmmol) 20ml的乙醇（溶劑乙醇的濃度為40v/v% )溶 液，滴加到含有l(wèi)mmol2-苯甲酰基吡啶縮氨基硫脲配體的20ml乙醇（溶劑乙醇的濃度為 70v/v% )溶液中，于50°C回流攪拌2h，將反應(yīng)后溶液過濾到50ml燒杯中，并用保鮮膜封 口，針扎30個孔于8°C揮發(fā)數(shù)日，得到深棕色晶體。所得深棕色晶體經(jīng)元素分析、紅外光譜、 核磁共振和單晶衍射分析，確定為本發(fā)明所述的以2-苯甲酰基吡啶縮氨基硫脲為配體的 銅（Π)金屬配合物。
[0054] 實施例3:BpT配合物的合成
[0055]a)將lOmmol的2-苯甲酰基R比啶溶解于10ml的甲醇（溶劑甲醇的濃度為80v/ v% )中，于50°C攪拌15min，制得溶液，將上述溶液逐滴滴入20ml加有l(wèi)Ommol氨基硫脲的 甲醇（溶劑甲醇的濃度為60v/v% )溶液中，于35°C條件下攪拌48h，得淡黃色沉淀物，將上 述所得淡黃色沉淀過濾后用甲醇洗3次，干燥后，得配體2-苯甲酰基吡啶縮氨基硫脲；
[0056]b)將含有CuBr2 (223. 35mg，lmmol) 20ml的乙醇（溶劑乙醇的濃度為30v/v% )溶 液，滴加到含有l(wèi)mmol2-苯甲?；拎たs氨基硫脲配體的20ml乙醇（溶劑乙醇的濃度為 20v/v% )溶液中，于40°C條件下攪拌36h，將反應(yīng)后溶液過濾到50ml燒杯中，并用保鮮膜 封口，針扎20個孔于2 °C揮發(fā)數(shù)日，得到深棕色晶體。所得深棕色晶體經(jīng)元素分析、紅外光 譜、核磁共振和單晶衍射分析，確定為本發(fā)明所述的以2-苯甲酰基吡啶縮氨基硫脲為配體 的銅（Π)金屬配合物。
[0057] 實施例4 :HSA-5FU-BpT-AS1411復(fù)合物的合成
[0058] 1)將BpT配合物（按實施例1所述方法制得）用DMS0配成溶液，取人血清白蛋 白用水配成溶液。將BpT的DMS0溶液、5FU以及人血清白蛋白的水溶液三者按物質(zhì)的量為 1:1:1混合，室溫孵育過夜，所得混合物濃縮，直至DMS0的含量小于或等于0. 01 %，水洗，得 HSA-5FU-BpT復(fù)合物。
[0059] 2)取AS1411溶解于PBS水溶液，加入5倍摩爾量的交聯(lián)劑SMPB，室溫條件下反應(yīng) 30分鐘，未反應(yīng)的SMPB使用凝膠層析過濾掉。然后將上述所得AS1411-SMPB復(fù)合物緩慢滴 加至HSA-5FU-BpT復(fù)合物中，讓其在氮氣環(huán)境下4°C反應(yīng)20小時。未綴合到白蛋白復(fù)合物 中的適體-SMPB通過凝膠層析過濾除去，超濾濃縮即得到HSA-5FU-BpT-AS1411復(fù)合物。所 得復(fù)合物經(jīng)單晶衍射分析，其整體結(jié)構(gòu)圖如圖3所示。圖4為所得復(fù)合物中5-氟尿嘧啶和 銅金屬配合物的電子云密度圖，其中（a)為5-氟尿嘧啶的電子云密度圖，（b)為銅金屬配 合物的電子云密度圖。圖5為所得復(fù)合物中5-氟尿嘧啶以及銅金屬配合物分別與人血清 白蛋白作用結(jié)合位點圖，其中（a)為5-氟尿嘧啶與人血清白蛋白作用結(jié)合位點圖，（b)為 銅金屬配合物與人血清白蛋白作用結(jié)合位點圖。所得復(fù)合物的質(zhì)譜圖如圖6所示。
[0060] 實驗例：本發(fā)明所述HSA-5FU-BpT-AS1411復(fù)合物在小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性實驗的 方法，建立了小鼠腫瘤模型。具體實驗方法如下：
[0061] 小鼠的飼養(yǎng)是在12小時明暗周期下，定期喂養(yǎng)并可以獲得自由飲水。將Bel-7402 的人腫瘤細(xì)胞收獲并懸浮于1:1的RPMI和基質(zhì)膠中，將其注入到小鼠的右側(cè)側(cè)腹，臺盼 藍(lán)染料排除法測定注入活細(xì)胞數(shù)量為5X106個，使用游標(biāo)卡尺測量并計算出腫瘤體積。 當(dāng)雌性小鼠體內(nèi)的植入腫瘤達(dá)到100立方毫米的體積時，每隔兩天通過尾靜脈注射入 5FU(0. 1μΜ/Kg，藥物量/小鼠體重，下同）、三種組合藥物[AS1411 (8. 470mg/Kg，(λ1μΜ/ Kg)+5FU(0. 126mg/Kg, 0· 1yM/Kg)+BpT(0. 355mg/Kg, 0· 1μΜ/Kg)]或HSA-5FU-BpT-AS1411 復(fù)合物（0. 1μM/Kg)，并每天對小鼠的體重和腫瘤體積進(jìn)行記錄。上述攜帶腫瘤的小鼠隨機 分成四組，每組7只，計算其存活率。每組的七只小鼠都是每兩天接受一次抗癌藥物尾靜脈 注射，設(shè)置的對照組則是每兩天注射等量的30%丙二醇/鹽水。
[0062] 體內(nèi)白蛋白復(fù)合物的靶向性：體內(nèi)試驗結(jié)束時，收集小鼠的腫瘤細(xì)胞，分別在馬弗 爐里2000°C下煅燒。使用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES)對小鼠腫瘤內(nèi)銅含 量進(jìn)行測定，結(jié)果如下述表1所示。
[0063] 表1 :28天抗癌活性實驗后異種移植的BEL-7402處理的小鼠各靜脈器官重量。
[0064]
[0065] 由表1可知，28天后，植入BEL-7402肝癌細(xì)胞的小鼠中腫瘤為2. 45±0.50g;經(jīng) 三種藥物處理后，腫瘤生長得到很好的抑制，重量為1. 33±0. 30g;而本發(fā)明所述復(fù)合物 HSA-5FU-BpT-AS1411對腫瘤細(xì)胞的生長有更加明顯的抑制作用，重量為0. 25±0. 04g。與 此同時我們可以發(fā)現(xiàn)，三種藥物處理的小鼠肝臟發(fā)生浮腫，重量增加，而小鼠的體重較初始 時減少了近10%，說明三種藥物對小鼠正常生長存在很大毒副作用。而經(jīng)本發(fā)明所述復(fù)合 物處理的小鼠肝臟重量沒有多大變化，小鼠的體重也沒有太大變化，說明白蛋白復(fù)合藥物 對小鼠毒副作用很小。
[0066] 組織學(xué)研究：切下器官，固定在10%的福爾馬林中，切片，并用蘇木精、曙紅和 TUNEL染色，通過顯微鏡進(jìn)行觀察，其結(jié)果如圖7所示。其中A為28天后對不同藥物組和對 照組腫瘤細(xì)胞使用蘇木精和曙紅染色的圖片，B為28天后對不同藥物組和對照組腫瘤細(xì)胞 使用TUNEL染色的圖片，C為28天后對不同藥物組和對照組肝臟細(xì)胞使用蘇木精和曙紅染 色的圖片。
[0067] 由圖7中A和B-系列圖片顯示，與單個5-FU相比以及多藥物作用相比，白蛋白 復(fù)合物更加促進(jìn)了Bel-7402腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死。由于三種藥物導(dǎo)致肝臟重量增加，我 們對小鼠肝臟細(xì)胞進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)三種藥物作用導(dǎo)致肝臟細(xì)胞空泡化增加，說明其毒性 較大，而白蛋白復(fù)合物作用時肝臟細(xì)胞空泡化并不明顯。
【主權(quán)項】
1. 人血清白蛋白-藥物復(fù)合物，其特征在于：該復(fù)合物是W人血清白蛋白為載體，在人 血清白蛋白IB子域中酪氨酸161和組氨酸146兩個位點上共同結(jié)合5氣尿喀晚，在人血清 白蛋白的IIA子域中組氨酸242位點上結(jié)合有銅（II)金屬配合物，該銅（II)金屬配合物 具有如下式（I)所示結(jié)構(gòu)，在人血清白蛋白的半脫氨酸34位點上通過交聯(lián)劑結(jié)合有富G寡 核巧酸；2. 權(quán)利要求1所述人血清白蛋白-藥物復(fù)合物的合成方法，其特征在于：取如下式（I) 所示結(jié)構(gòu)的銅（II)金屬配合物、5-氣尿喀晚W及人血清白蛋白進(jìn)行解育，解育所得混合物 進(jìn)行濃縮、洗涂，然后通過交聯(lián)劑接上富G寡核巧酸即得；3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述人血清白蛋白-藥物復(fù)合物的合成方法，其特征在于：所述的 交聯(lián)劑為N-班巧酷亞胺基-4-(4-馬來酷亞胺苯基）下酸鹽。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述人血清白蛋白-藥物復(fù)合物的合成方法，其特征在于：包 括W下步驟： 1) 取式（I)所示結(jié)構(gòu)的銅（II)金屬配合物、5-氣尿喀晚W及人血清白蛋白進(jìn)行解育， 解育所得混合物進(jìn)行濃縮、洗涂，得到HSA-5即-BpT復(fù)合物； 2)取富G寡核巧酸溶解于PBS緩沖液，加入過量的交聯(lián)劑，反應(yīng)，所得產(chǎn)物滴加 到HSA-5即-BpT復(fù)合物中，在保護(hù)氣氛下解育，解育所得混合物進(jìn)行濃縮、洗涂，得到 服A-5即-BpT-AS1411復(fù)合物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述人血清白蛋白-藥物復(fù)合物的合成方法，其特征在于：步驟2) 中，加入交聯(lián)劑后的反應(yīng)在低于40°C的條件下進(jìn)行。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述人血清白蛋白-藥物復(fù)合物的合成方法，其特征在于：步驟2) 中，當(dāng)反應(yīng)在20~30°C條件下進(jìn)行時，反應(yīng)的時間為20~60min。7. 權(quán)利要求1所述人血清白蛋白-藥物復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。 8. W權(quán)利要求1所述人血清白蛋白-藥物復(fù)合物為活性成分制備的抗腫瘤藥物。9. 一種W2-苯甲酯基化晚縮氨基硫脈為配體的銅（II)金屬配合物或其藥學(xué)上可接受 的鹽，具有如下式（I)所示結(jié)構(gòu)：10.權(quán)利要求9所述的銅（II)金屬配合物的合成方法，包括w下步驟： 1) 取2-苯甲酯基化晚和氨基硫脈，W醇類物質(zhì)作為溶劑，進(jìn)行反應(yīng)，有沉淀生成，收集 沉淀，洗涂，得到配體2-苯甲酯基化晚縮氨基硫脈； 2) 取配體2-苯甲酯基化晚縮氨基硫脈和化化2,W醇類物質(zhì)作為溶劑，進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng) 物靜置、析晶，收集晶體，即得到目標(biāo)產(chǎn)物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人血清白蛋白-藥物復(fù)合物及其合成方法和應(yīng)用。所述的人血清白蛋白-藥物復(fù)合物是以人血清白蛋白為載體，在人血清白蛋白IB子域中酪氨酸161和組氨酸146兩個位點上共同結(jié)合5氟尿嘧啶，在人血清白蛋白的II？A子域中組氨酸242位點上結(jié)合有銅(II)金屬配合物，在人血清白蛋白的半胱氨酸34位點上通過交聯(lián)劑結(jié)合有富G寡核苷酸。申請人對所得復(fù)合物進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤活性研究，結(jié)果表明，以白蛋白為基礎(chǔ)的多藥物遞送系統(tǒng)較單獨的三種藥物提高了靶向性以及治療效果，且毒性更低。
【IPC分類】A61K31/555, A61K31/7088, A61P35/00, A61K47/48, A61K31/513
【公開號】CN105396142
【申請?zhí)枴緾N201510923314
【發(fā)明人】楊峰, 張振雷, 齊金旭, 茍嶧, 張耀, 王俊
【申請人】廣西師范大學(xué)
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年12月14日