用于癌癥靶向治療和診斷成像的包含基于修飾的血紅蛋白的治療劑的藥物組合物的制作方法
【專利說明】用于癌癥靶向治療和診斷成像的包含基于修飾的血紅蛋白 的治療劑的藥物組合物
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[0003] 對相關申請的交叉引用
[0004] 本申請要求2013年5月13日提交的美國臨時專利申請序列號61/822,463以及 2014年5月13日提交的美國非臨時專利申請序列號14/275, 885的優(yōu)先權，并且這些專利 申請的公開內容以引用的方式整體并入本文。
技術領域
[0005] 本發(fā)明描述了基于血紅蛋白的治療劑，所述治療劑已經(jīng)被化學修飾以形成具有靶 向癌細胞的能力的物質。本發(fā)明進一步描述了一種用于化學工程化以形成基于血紅蛋白的 治療劑的設計。本發(fā)明進一步涉及含有基于血紅蛋白的治療劑的藥物組合物，所述藥物組 合物用于人類和其它動物的癌癥靶向治療，特別是用于肝癌、乳腺癌、胰腺癌、以及對應的 祖細胞誘導的腫瘤或與對應的祖細胞相關的腫瘤。此外，本發(fā)明提供了一種熒光標記的修 飾的血紅蛋白，所述血紅蛋白用于活細胞成像和診斷成像。
【背景技術】
[0006] 化療是使用抗癌藥來治療癌細胞?；煻嗄陙硪恢北皇褂貌⑶沂怯糜诎┌Y的最常 見的治療之一。在大多數(shù)情況下，化療通過干擾癌細胞生長或繁殖的能力來起作用。不同 組的藥物以不同的方式起作用以對抗癌細胞?；熆梢詥为氂糜谝恍╊愋偷陌┌Y或與其它 治療，如放射（或放療）或手術組合使用。常常，使用化療藥物的組合來對抗特定的癌癥。 常用的化療藥物超過50種。
[0007] 雖然化療在治療某些癌癥方面可以是相當有效的，但是化療藥物到達身體的所有 部分，而不僅僅是癌細胞。正因為如此，所以在治療期間可能存在許多副作用。因此，需要具 有一種用于降低化療藥物的劑量以在癌癥治療期間減輕副作用并且維持它的功效的方法。 對于降低劑量來說，它可以有益于患者（更小的副作用）和化療藥物的制造商（更低的生 產(chǎn)成本）這兩者。
[0008] 常見的放療劑包括銠-105絡合物、釤-153絡合物以及其它相關的絡合物；這些藥 劑對癌癥患者也具有許多副作用。
[0009] 缺氧在癌癥中是常見的。缺氧和貧血（這促使腫瘤缺氧）可以通過使腫瘤細胞喪 失氧而產(chǎn)生電離放射和化療抗性，氧對這些藥劑的細胞毒性活性來說是必要的。缺氧還可 能經(jīng)由包括蛋白質組和基因組的變化在內的一種或多種間接的機制來降低腫瘤對放療和 化療的敏感性。
[0010] 因此，在本領域中對靶向癌細胞和癌組織，同時減少癌癥治療對非癌細胞和非癌 組織的影響的改進的癌癥治療存在需要。

【發(fā)明內容】

[0011] 在本發(fā)明中，提供了一種靶向癌細胞以由治療藥物（例如化療劑、放療劑）有效殺 死癌細胞的基于血紅蛋白的治療劑。常見的化療劑和放療劑被廣泛用于不同的患者，然而， 發(fā)現(xiàn)許多副作用。這些問題可以通過對血紅蛋白進行化學修飾并且使它與一種或多種治療 藥物連接來克服。當與公知的用于癌癥的治療藥物（例如化療藥物，包括5-氟尿嘧啶、替 莫挫胺（Temozolomide)、順鉬（Cisplatin))相比時，本發(fā)明的基于血紅蛋白的治療劑不僅 可以靶向癌細胞，而且在治療腫瘤方面也是更加有效的。此外，由于可以低劑量使用所述靶 向癌癥的基于血紅蛋白的治療劑，因此大大地減少了治療藥物所帶來的不利副作用。
[0012] 大多數(shù)治療藥物是非常昂貴的。如果降低治療劑量的話，那么每一個患者的治療 成本可以被顯著降低?；谘t蛋白的治療劑是一種很好的用于降低治療劑量的方法，這 是因為修飾的血紅蛋白可以靶向癌細胞。
[0013] 本發(fā)明要求保護的基于血紅蛋白的治療劑還可以與一種或多種熒光探針連接以 有助于活細胞成像和診斷成像。即，所述與熒光素綴合的基于血紅蛋白的治療劑可以被攝 取到肝癌細胞和乳腺癌細胞中。細胞對與熒光素新綴合的基于血紅蛋白的治療劑的攝取是 通過在如下文所述的一系列活細胞攝取研究中將其立即用于所述細胞來驗證的。觀測到 所述與熒光素綴合的基于血紅蛋白的治療劑在暴露15分鐘之后被攝取到肝癌細胞（例如 HepG2細胞系）和乳腺癌細胞中，并且在暴露1小時之后信號達到峰值。
[0014] 可以使一個或多個熒光素分子（例如七個熒光素分子）與一個穩(wěn)定化的血紅蛋白 分子連接以增強活細胞成像和診斷成像的信號。本發(fā)明還對靶向癌細胞以用于癌癥治療的 與一種或多種熒光探針綴合和沒有與一種或多種熒光探針綴合的基于血紅蛋白的治療劑 進行比較。在本發(fā)明的比較研究中，當與單獨的治療藥物相比時，所述基于血紅蛋白的治療 劑的劑量可以被降低。所述結果支持了本發(fā)明要求保護的基于血紅蛋白的治療劑可以大大 地減輕由治療藥物所產(chǎn)生的副作用。
[0015] 因此，本發(fā)明的第一個方面在于構建一種用于靶向癌細胞的具有可以用作與治療 藥物的連接（linkage)的一種或多種官能團的化學修飾的血紅蛋白。本發(fā)明的第二個方面 在于經(jīng)由可切割的或不可切割的連接或接頭（1inker)使修飾的血紅蛋白或穩(wěn)定化的血紅 蛋白與治療藥物（活性劑）進行化學連接以殺死癌細胞?？梢耘c本發(fā)明的血紅蛋白分子連 接的治療藥物或活性劑包括但不限于化療藥物，例如5-氟尿嘧啶、替莫唑胺、順鉑；或放療 藥物，例如銠-105絡合物、釤-153絡合物以及其它相關的絡合物；或任何其它治療藥物或 化合物，所述治療藥物或化合物被證明有效治療或減輕癌癥并且能夠容易地與本發(fā)明的血 紅蛋白分子連接、經(jīng)由所述接頭與穩(wěn)定化的血紅蛋白分子或與化學修飾的血紅蛋白分子連 接。除與治療藥物連接之外，本發(fā)明的穩(wěn)定化的或修飾的血紅蛋白分子還可以與細胞或熒 光標記劑連接，所述熒光標記劑包括但不限于熒光蛋白、非蛋白質有機熒光團、熒光納米粒 子以及基于金屬的發(fā)光染料。
[0016] 本發(fā)明進一步涉及用于人類和其它動物的靶向癌癥治療的含有基于血紅蛋白的 治療劑的藥物組合物。所述組合物包括治療有效量的所述治療劑和藥學上可接受的載體、 鹽、緩沖劑、水或其組合以用于治療癌癥。本發(fā)明的第三個方面在于提供一種使用本發(fā)明的 含有基于血紅蛋白的治療劑的藥物組合物治療癌癥的方法，所述方法是通過向有需要的患 有各種腫瘤和癌癥的受試者施用所述組合物來實現(xiàn)的。所述組合物可以通過包括但不限于 靜脈內注射、腹膜內注射以及皮下注射的各種途徑向所述受試者施用。所述基于血紅蛋白 的治療劑的可切割的形式和不可切割的形式這兩者均含有活性劑，如化療劑（例如5-氟尿 嘧啶、5FU)，當在體外癌癥模型和體內癌癥模型這兩者中測試時，所述活性劑顯示出功效， 所述癌癥模型包括肝癌（肝細胞癌）、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、白血病、成膠質細胞瘤、 以及乳腺癌（三陰性乳腺癌）以及胰腺癌。
[0017] 本發(fā)明的基于血紅蛋白的治療劑還被化學修飾以有助于使所述治療劑靶向癌細 胞而使得它更有效殺死癌細胞。血紅蛋白（Hb)可以被化學修飾并且與不同的治療劑（例 如5FU、替莫唑胺、順鉑等）連接。來自不同來源的血紅蛋白是一種靶向癌細胞的蛋白質。 這種靶向特性有助于有效地殺死癌細胞、癌癥干細胞和/或癌癥祖細胞。因而，可以降低所 述治療劑的劑量。
[0018] 用于本發(fā)明中的基于血紅蛋白的治療劑可以用于治療各種癌癥，如胰腺癌、白血 病、頭頸部癌、結腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌以及腦癌。本發(fā)明涉及基于 血紅蛋白的治療劑、治療癌癥的方法、以及治療和/或抑制癌組織轉移和癌組織復發(fā)的方 法，包括但不限于肝癌（其可以在肝癌祖細胞誘導的腫瘤異種移植模型中被例證）、乳腺 癌，特別是三陰性乳腺癌（其可以在三陰性祖細胞誘導的腫瘤異種移植模型中被例證）。腫 瘤內的細胞在性質上是異質的。它一般被認為是由以下各項構成的：（1)大多數(shù)的具有有 限的分裂能力的癌細胞；以及（2) -群稀有的癌癥干細胞樣細胞（CSC)，它們也被稱為祖細 胞，它們可以形成新的腫瘤細胞并且在性質上具有高轉移性。由于CSC化學抗性和轉移性 的固有特性，因此它們已經(jīng)被假定為造成癌癥患者的復發(fā)。如本發(fā)明的實施方案中的一個 中所述的腫瘤祖細胞誘導的小鼠模型是腫瘤轉移和復發(fā)的最好的代表性模型。
[0019] 由于血紅蛋白部分可以帶來氧以殺死癌癥干細胞，而治療劑部分可以殺死癌細 胞，因此本發(fā)明的基于血紅蛋白的治療劑在癌癥治療中將提供協(xié)同作用。
【附圖說明】
[0020] 圖1示出了用于構建基于血紅蛋白的治療劑的設計方法。一種或多種治療藥物可 以與修飾的血紅蛋白連接以形成基于血紅蛋白的治療劑?？梢越?jīng)由可切割的連接（1A)或 不可切割的連接（1B)使修飾的血紅蛋白或穩(wěn)定化的血紅蛋白與治療劑進行化學連接。
[0021] 圖2示出了來自不同物種的血紅蛋白的氨基酸序列。
[0022] 圖3A示出了由（1)酐、（2)烯酮以及（3)NHS酯化學修飾的血紅蛋白。
[0023] 圖3B示出了由以下各項化學修飾的血紅蛋白：（1)甲醇胺、（2)碳酸酯、（3)縮醛 胺、（4)脲、（5)酰胺（2-碳鏈）、（6)酰胺（1-碳鏈）、（7)具有烷基鏈的二硫化物、（8)具 有甲醇胺的二硫化物以及（9)二硫化物。
[0024] 圖4示出了用于（A)Hb-5FU-烷基（不可切割）綴合物和⑶Hb-5FU-甲醇胺（可 切割）綴合物的合成方案。
[0025] 圖5示出了以下各項的LC-MS結果：(A)穩(wěn)定化的血紅蛋白；(B)基于修飾的血紅 蛋白的5FU(不可切割的綴合物）或Hb-5FU-烷基（不可切割）綴合物；以及（C)基于修飾 的血紅蛋白的5FU(可切割的綴合物）或Hb-5FU-甲醇胺（可切割）綴合物。
[0026] 圖6示出了在HPLC研究中5FU從（A) 5FU-甲醇胺（可切割）模型和5FU-烷基 (不可切割）模型以及（B)基于血紅蛋白的5FU綴合物（Hb-5FU-甲醇胺（可切割）綴合 物）的釋放。
[0027] 圖7示出了在胰腺癌Capan-Ι動物模型中基于血紅蛋白的5FU的功效（腫瘤尺 寸）。
[0028] 圖8示出了在胰腺癌Capan-Ι動物模型中基于血紅蛋白的5FU的功效（腫瘤重 量）。
[0029] 圖9示出了在藥物處理之后攜帶Capan-Ι異種移植物的動物模型（小鼠）的體重 增加。
[0030] 圖10示出了在肝癌SMMC7221動物模型中基于血紅蛋白的5FU的功效（腫瘤尺 寸）。
[0031] 圖11示出了在肝癌SMMC7221動物模型中基于血紅蛋白的5FU的功效（腫瘤重 量）。
[0032] 圖12示出了在⑶133+肝癌祖細胞/癌癥干細胞樣細胞Η印G2動物模型中基于血 紅蛋白的5FU的功效（腫瘤尺寸）。
[0033] 圖13示出了在⑶44+⑶24-乳腺癌祖細胞/癌癥干細胞樣細胞MCF7動物模型中 基于血紅蛋白的5FU的功效（腫瘤尺寸）。
[0034] 圖14示出了在體外在HCT116結腸癌中基于血紅蛋白的5FU的功效（細胞毒性）。
[0035] 圖15示出了在