療由深靜脈返流和 /或靜脈高壓導(dǎo)致的復(fù)發(fā)性下肢腫瘤的用途。
[0041] 本公開特征在于通過本文中所述的任一方法生產(chǎn)的瓣膜，其中經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜 是CD31陽性的。該經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜還可以是平滑肌肌動蛋白陽性的、vWF陽性的、和/或 特征在于存在梭形平滑肌細(xì)胞。經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜具有在第一峰高于0. 8N的力學(xué)性能。
[0042] 本公開的特征還在于本文中所述的任一方法生產(chǎn)的瓣膜用于植入或接枝的用途， 其中，經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜是CD31陽性的。該經(jīng)再細(xì)胞化瓣膜還可以是平滑肌肌動蛋白陽性 的、vWF陽性的、和/或特征在于存在梭形平滑肌細(xì)胞。經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜具有在第一峰高 于〇· 8N的力學(xué)性能。
[0043] 本公開提供了瓣膜的再細(xì)胞化，其接枝入有需要的受試者，治療和/或改善在大 腿部功能不全的瓣膜的癥狀。在一個方面，治療和/或改善癥狀是通過恢復(fù)肌肉栗和靜脈 瓣間正常的工作關(guān)系實(shí)現(xiàn)的。下肢的肌肉栗包括腳部、小腿、和大腿的那些肌肉栗。這些中， 小腿栗是最重要的，因其是最有效的、具有最大的容量、以及形成最高的壓力（在肌肉收縮 時(shí)200mm汞柱）。正常的肢體具有從1500至3000cc范圍的小腿容量，100至150cc的靜脈 容量，且單次收縮擠壓超過靜脈容量的40 %至60%。
[0044] 在收縮期，腓腸肌和比目魚肌推動血液至大容量的胭和股靜脈。在隨后的舒張期， 本公開的經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜防止倒流（返流），形成負(fù)壓力，且通過有能力的穿透靜脈牽引 血液從淺靜脈至深靜脈系統(tǒng)。經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜逐步降低靜脈壓，直到動脈流入等于靜脈 流出。當(dāng)受試者停止運(yùn)動，具有經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜的靜脈緩慢地填充毛細(xì)血管床，導(dǎo)致緩慢 回到靜息靜脈壓。
[0045] 盡管大腿靜脈被肌肉包圍，大腿肌肉收縮對靜脈回流的貢獻(xiàn)與小腿肌肉栗相比很 小。在行走中，足底靜脈叢是被壓縮的，其栗作用被認(rèn)為是引發(fā)小腿栗。各種腿部栗與有能 力的瓣膜功能共同作用將靜脈血液從遠(yuǎn)端回流至近端肢體。
[0046] 除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員所通常理解的相同含義。盡管與本文所述那些相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡捎糜趯?shí)施 或檢驗(yàn)本公開，下文描述了合適的方法和材料。此外，材料、方法和實(shí)施例僅為說明性的，而 不意在限制。本文所提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)通過引用以其整體 結(jié)合。若不一致，則以本說明書為準(zhǔn)，包括定義。
[0047] 本公開的詳細(xì)說明在所附附圖和下文說明中闡述。本公開的其它特征、目標(biāo)和優(yōu) 點(diǎn)將從附圖和詳細(xì)說明以及從權(quán)利要求書中顯而易見。
【附圖說明】
[0048] 圖1顯示裝置的照片，以及用于靜脈功能測試的體外模型。該系統(tǒng)循環(huán)有室溫的 含有用于提高多普勒信號的超聲造影劑的生理鹽水。蠕動栗（a)栗送生理鹽水通過整個回 路，機(jī)械閥（b)使在栗輸出期間的流動通過靜脈（c)。超聲波探頭（d)用于靜脈（e)的可視 化，以及流動通過靜脈瓣膜的評估。通過在靜脈上方的容器（f)的高度調(diào)節(jié)在瓣膜位置的 返流壓力。機(jī)械閥能控制流動的方向，以及允許測試瓣膜功能，帶瓣靜脈段裝于回路中，并 置于填充有生理鹽水容器中，通過超聲促進(jìn)可視化；瓣膜閉合時(shí)間評估；在瓣膜位置的返 流壓力通過靜脈上方的容器的高度調(diào)節(jié)。
[0049] 圖2 (A-D)顯示經(jīng)脫細(xì)胞化的含瓣膜靜脈段的總體形態(tài)和微觀視圖。（A)正常靜脈 和（B)在14個周期后經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈的總體形態(tài)。14個周期后經(jīng)脫細(xì)胞化的（C)靜脈 的HE染色顯示保留組織構(gòu)造和藍(lán)-黑色細(xì)胞核的缺失，以及（D)正常靜脈顯示細(xì)胞核的存 在。
[0050] 圖3(A_D)顯示經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈中細(xì)胞外基質(zhì)。㈧正常靜脈的馬松三色 (Masson'sTrichrome，MT)染色顯示存在細(xì)胞核（黑）、細(xì)胞質(zhì)（紅/粉紅）和膠原蛋白 (藍(lán)）。（B)在經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈（DV)中，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核，表明缺少內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞，但膠 原蛋白的染色表明膠原蛋白仍然存在。（C)直方圖顯示在14個脫細(xì)胞化周期后，膠原蛋白 和GAG的量分別顯著降低（P值為0. 03和0. 005)。（D)直方圖顯示在脫細(xì)胞化后DNA的量 顯著降低（P值為〇. 0001)。在3A-3B中，基準(zhǔn)尺=50ym。
[0051] 圖4 (A-F)顯示含經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜的靜脈段的特征。（Α)和（Β)分別在低和高放 大倍數(shù)下，經(jīng)再細(xì)胞化的靜脈和瓣膜的蘇木精和伊紅（HE)染色的顯微圖像。圖片顯示靜脈 和瓣膜（箭頭）的內(nèi)皮襯里（endotheliallining)上存在連續(xù)的細(xì)胞。（C)HE和馬松三色 (MT)染色正常和經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜顯示在靜脈所有的視圖中存在細(xì)胞核。（D)經(jīng)再細(xì)胞化 靜脈的CD31染色顯示連續(xù)的內(nèi)皮襯里。（E)瓣膜的平滑肌肌動蛋白染色顯示瓣膜中平滑肌 細(xì)胞的存在。（F)α-平滑肌肌動蛋白的染色顯示經(jīng)再細(xì)胞化的靜脈培養(yǎng)基中的平滑肌細(xì) 胞。
[0052] 圖5 (Α-Ε)顯示使用自體全外周血經(jīng)生物工程改造的靜脈接枝的圖像。（Α)經(jīng)組織 工程改造的靜脈的免疫熒光染色。放大倍數(shù)為100Χ。（Β)經(jīng)生物工程改造的瓣膜的免疫熒 光圖像，其使用抗-CD31抗體染色以表明管腔中存在內(nèi)皮細(xì)胞（綠色）。放大倍數(shù)為200Χ。 (C)抗-⑶31抗體染色的陰性對照。放大倍數(shù)為200Χ。用抗-平滑肌肌動蛋白免疫組織化 學(xué)染色的經(jīng)組織工程改造的靜脈，顯示外膜層（tunicaadventitialayer)明顯存在平滑 肌細(xì)胞（箭頭）。（D)顯示瓣膜的經(jīng)再細(xì)胞化的靜脈總體照片。（E)具有功能性瓣膜的靜脈 的照片。瓣膜顯示腫脹，表明在新鮮獲取的經(jīng)脫細(xì)胞化和再細(xì)胞化的靜脈中，當(dāng)通過注射器 注射溶液時(shí)，液體保留。
[0053] 圖6 (Α-C)顯示經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜的力學(xué)分析。（A)正常的和經(jīng)再細(xì)胞化的（RC) 靜脈瓣的變形行為的代表圖。水平方向逐步撕碎瓣膜導(dǎo)致一系列的峰。（B)來自相同靜脈 的每對瓣膜在第一峰的力。正常靜脈瓣膜是用方形標(biāo)記，而RC瓣膜用圓形標(biāo)記。綠色標(biāo)記 功能性瓣膜，而紅的標(biāo)記功能不全的。藍(lán)線代表在第一峰迫使靜脈需要發(fā)揮功能的力的大 小的截?cái)嘀担?.8N)。（C)工作瓣膜的平均力的箱圖表明正常瓣膜和經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜間無 顯著差異。
[0054] 圖7顯示一系列超聲圖像，顯示經(jīng)組織工程改造的含瓣膜靜脈的功能性測試的階 段。組（a)-(f)顯示靜脈段的2-D縱向超聲投影。閉合瓣膜（a)，以及在順行流動中瓣膜的 逐步張開（b_d)，逆行流動時(shí)瓣膜的逐步閉合（e)和（f)。
[0055] 圖8顯示經(jīng)組織工程改造的含瓣膜靜脈的功能性測試。在下面的圖像（a)-(c)中 黃色多普勒基準(zhǔn)顯示以秒記的瓣膜閉合時(shí)間。
[0056] 圖9(A_B)顯示證明生物力學(xué)測試的一系列圖片。（A)在縱向切割后的靜脈圖片， 以實(shí)施撕拉測試和瓣膜的延伸，同時(shí)使用英斯特朗測試機(jī)（instrontester)測試。（B)在 切割靜脈上實(shí)施撕拉測試的英斯特朗測試機(jī)的圖片。
[0057] 圖10 (A-G)顯示經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈的免疫組織化學(xué)分析。（A)正常靜脈的DAPI 染色顯示數(shù)個細(xì)胞核，但是（B)經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈不顯示DAPI-染色的細(xì)胞核。（C)經(jīng)脫 細(xì)胞化的靜脈的免疫組織化學(xué)染色顯示HLAI類抗原表達(dá)的缺失和（D)HLAII類抗原表達(dá) 的缺失。（E)正常靜脈染色HLAI類（褐色）陽性，但無（F)HLAII類。（G)陰性對照。以 (Α)50χ、（Β)ΙΟΟχ的放大倍數(shù)。
[0058] 圖11 (Α-D)顯示經(jīng)再細(xì)胞化的靜脈。（A)顏色為出現(xiàn)粉紅色的正常（A)和經(jīng)再細(xì) 胞化的靜脈（B)的總體形態(tài)，DAPI染色顯示在正常靜脈中（C)和經(jīng)使用外周全血再細(xì)胞化 的靜脈中（D)大量細(xì)胞核。以ΙΟΟχ放大倍數(shù)。
[0059] 圖12A是人腿部中深靜脈的素描簡圖。圖12B是當(dāng)靜脈中單向瓣膜開啟和閉合時(shí) 的簡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0060] 本公開的詳細(xì)說明已在下文說明中闡述。盡管與本文所述那些相似或相當(dāng)?shù)姆椒?和材料可用于實(shí)施或檢驗(yàn)本公開，本文中描述了該方法和材料。本公開的其它特征、目標(biāo)和 優(yōu)點(diǎn)將從說明以及從權(quán)利要求書中顯而易見。在說明和所附的權(quán)利要求中，除非上下文另 有明確規(guī)定，單數(shù)形式包含復(fù)數(shù)指代。
[0061] 為了方便起見，在說明、實(shí)施例和權(quán)利要求中所使用的特定術(shù)語收集于此。除非另 有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解 的相同含義。
[0062] 定義
[0063] 如本文所使用的"再細(xì)胞化"指這樣的過程：將細(xì)胞引入或遞送至經(jīng)脫細(xì)胞化的靜 脈，并培養(yǎng)該細(xì)胞使得細(xì)胞增殖和/或分化以最終再生具有與正常帶瓣靜脈相似的構(gòu)造、 細(xì)胞組構(gòu)和生物活性的瓣膜。
[0064] 如本文所使用的"脫細(xì)胞化"是指從瓣膜除去細(xì)胞的過程。有效的脫細(xì)胞化取決于 例如組織密度和組構(gòu)、終產(chǎn)物期需的幾何學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)以及靶向的臨床應(yīng)用等因素。保 留ECM完整性和生物活性的瓣膜脫細(xì)胞化可由本領(lǐng)域技術(shù)人員例如，通過在處理期間選擇 特定試劑和技術(shù)優(yōu)化。用于脫細(xì)胞化的試劑可能取決于許多因素，包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)、密度、月旨 質(zhì)含量和靜脈厚度。盡管大多數(shù)細(xì)胞去除試劑和方法可改變ECM組成并導(dǎo)致一些程度的超 微結(jié)構(gòu)破壞，但期需將這些不良效果最小化。
[0065] 如本文所使用的"治療"是為獲得有益的或期需的效果的方法，其包括臨床效果。 對于本公開的目的，有益的或期需的臨床效果包括，但不限于一種或多種癥狀的減輕或改 善、疾病程度的降低、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定（即，未惡化）、防止疾病的擴(kuò)散、疾病進(jìn)程的延遲和 減緩、疾病狀態(tài)的改善或減輕、以及恢復(fù)（無論部分或全部）、無論可檢測或檢測不到。"治 療"還可意味著與未接受治療的預(yù)期生存相比，延長了生存。
[0066] 對于"減少"或該詞的其他形式，如"減少的"或"下降，"意思是一個事件或特征 (例如，CVI和/或腿部潰瘍）的降低。其被理解這通常是涉及一些標(biāo)準(zhǔn)或預(yù)期值，換言之 它是相對的，但是它并不是總是對所提及的標(biāo)準(zhǔn)或相對值所必要的。
[0067] 如本公開的方法的范圍內(nèi)為針對預(yù)防疾病或疾病狀態(tài)，其可被理解為術(shù)語"預(yù)防" 不要求完全去除（thwarted)該疾病狀態(tài)（例如，CVI和/或腿部潰瘍）。術(shù)語"預(yù)防"可包 含當(dāng)本文公開的經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜被施用/接枝/移植時(shí)部分有效，其作為一種措施降低 了癥狀或疾病進(jìn)程，例如，CVI和/或腿部潰瘍。效果可從部分有效延伸到不同程度的有效， 其包括個體被宣告治愈或沒有任何CVI和/或腿部潰瘍的癥狀。該術(shù)語不要求疾病狀態(tài)總 是被完全消除。
[0068] 如本文所使用的"減輕"疾病或疾病狀態(tài)意思是與未治療疾病相比，疾病狀態(tài)的程 度和/或不良臨床表現(xiàn)是減少的（或緩解的）和/或進(jìn)展的時(shí)間進(jìn)程是緩慢的或延長的。
[0069] 如本文所使用的"抑制的"、"抑制"和本文中使用的它的名詞變化和動詞變換，用 以描述經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜的生物學(xué)效果。其不必要求100%的抑制。該定義包含部分抑制。 該定義將包含與相關(guān)對照相比（例如，當(dāng)沒有使用化合物時(shí)所觀察的程度）任何程度的抑 制。
[0070] 如本文所使用的瓣膜的能力是指瓣膜閉合時(shí)間，或從倒流至流動終止的時(shí)間。具 備正常功能的瓣膜的瓣膜閉合時(shí)間等于或小于〇. 5秒。在實(shí)施方案中，本公開的經(jīng)再細(xì)胞 化的瓣膜可具有等于或小于〇. 5秒的瓣膜閉合時(shí)間（或能力）。
[0071 ] 如本文所使用的靜脈的返流，是指相對血液流向心臟的方向，血液的相反流動。具 備正常功能的瓣膜可承受或耐受約100mm汞柱的返流壓力，且在行走7至12步時(shí)，減少至 平均約18mm汞柱至約25mm汞柱。具備正常功能的瓣膜保持閉合，從而對高達(dá)100mm汞柱的 壓力防止返流，且在行走7至12步時(shí)，減少至平均約18mm萊柱至約25mm萊柱。在實(shí)施方 案中，經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜可證明為具有承受正常瓣膜所耐受的返流壓力（即，100mm汞柱） 的 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。
[0072] 本文所使用的"受試者"意思是人或動物（在動物的情況下，更典型的是哺乳動 物）。在一方面，受試者是人。在一方面，受試者是雄性。在一方面，受試者是雌性的。如本 文所使用的，"有需要的受試者"是具有與瓣膜疾病或功能不全相關(guān)的血管疾病或失調(diào)，或 者相對于普遍人群具有提高的發(fā)展為該血管疾病或失調(diào)風(fēng)險(xiǎn)而需要血管接枝或移植的受 試者。
[0073] 為提高對本文公開內(nèi)容的理解的目的，所引用的特征和特定語言使用了相同描 述。本文所使用的術(shù)語的目的僅在于描述特定特征，并不意在限制本公開的范圍。除上下 文另有明確規(guī)定，如本公開全文所使用的單數(shù)形式"一種" "一個"和"該"包括復(fù)數(shù)指代。 因此，例如，提及"一種瓣膜"，包括該組分的復(fù)數(shù)，和單數(shù)組分。除另有說明外，本文中所使 用的所有百分?jǐn)?shù)或比例是以重量計(jì)。
[0074] 除相反地特別聲明，組分的重量百分比是基于包含該組份的制劑或組合物的總重 量。術(shù)語"約"是指在一種試劑的濃度或量中任何最小限度的改變，其不改變該試劑在制備 制劑和疾病或失調(diào)的治療中的有效性。有關(guān)本公開的試劑（例如治療劑/活性試劑）的濃 度范圍的術(shù)語"約"也指不改變有效量或范圍的現(xiàn)有量或范圍的任意變化。
[0075] 在本文中，范圍可以從"約"一個特定值，和/或至"約"另一個特定值的形式表示。 當(dāng)以該形式表示一個范圍，另一方面包含從一個特定值和/或至其他特定值。相似地，當(dāng)通 過使用前述"約"以近似值表示值時(shí)，其被理解為該特定值形成另一方面。進(jìn)一步理解為， 范圍的每一端點(diǎn)相對于另一個端點(diǎn)均是有意義的，且獨(dú)立于另一個端點(diǎn)。其還理解為本文 公開存在數(shù)個值，且本文中每個值也是以"約"公開，是除該數(shù)值本身的特定數(shù)值。其還理 解為在申請全文中，以數(shù)個不同形式提供的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)代表端點(diǎn)和起點(diǎn)和數(shù)據(jù)點(diǎn)的任意 組合的范圍。例如，如果一個特定數(shù)據(jù)點(diǎn)" 10"和一個特定數(shù)據(jù)點(diǎn)" 15"被公開，其理解為高 于、高于或等于、少于、少于或等于、以及等于10和15,以及10和15間是被公開的。其也被 理解為兩個特定單位間的每一單位同樣被公開。例如，如果10和15被公開，則11、12、13 和14也被公開。
[0076] 靜脈血液是缺氧血液，其從外周血管，通過靜脈系統(tǒng)運(yùn)輸至心臟的右心房。缺氧血 液隨后由右心室通過肺動脈栗送至肺部，肺動脈劃分為兩分支，左和右分別對應(yīng)左和右肺。 在肺中血液是含氧的，并通過肺靜脈回流至左心房。
[0077] 出生后血管發(fā)生（vasculogenesis)為在成年人中由循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC)形成 新血管；以及血管形成（angiogenesis)為從預(yù)先存在的內(nèi)皮細(xì)胞形成新血管（RibattiD 等，2001)。這兩個過程促成靜脈分支的形成和致病狀態(tài)如傷口愈合、缺血、骨折愈合、腫瘤 生長等（Laschke等，2011)。
[0078] 本公開包括用于再細(xì)胞化靜脈的細(xì)胞群是同種異體的。如本文所使用的"同種異 體的"是指從與器官或組織來源相同的物種個體（即，有關(guān)或無關(guān)個體）獲取血液。
[0079] 如本文所使用的自體意思是供體和受體是相同的人。例如，安排非緊急手術(shù)的患 者可以是自體供體，其通過貢獻(xiàn)他們自己的血液，存儲血液至手術(shù)。自體接枝是一種由自身 提供的接枝（如皮膚接枝）。在實(shí)施方案中，本公開的再細(xì)胞化的方法包括引入從受體（即， 有治療需要的受試者（即，自體）獲得的血液或細(xì)胞。
[0080] 為提高對本文公開內(nèi)容的理解的目的，所引用的特征和特定語言使用了相同描 述。本文所使用的術(shù)語的目的僅在于描述特定特征，并不意在限制本公開的范圍。除上下 文另有明確規(guī)定，如本公開全文所使用的單數(shù)形式"一種" "一個"和"該"包括復(fù)數(shù)指代。 因此，例如，提及"一種組合物"，包括該組合物的復(fù)數(shù)，和單數(shù)組合物，以及"一種治療試劑" 是涉及一種或多種治療的和/或藥物試劑，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的等同物等。除另有 說明外，本文中所使用的