DF膜（提前在甲醇中 浸泡5-6min)、凝膠及轉(zhuǎn)膜裝置中的海綿置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡3~5min。在海綿上依次 放置：兩層濾紙、凝膠、PVDF膜、兩層濾紙。加緊海綿，放入轉(zhuǎn)移槽內(nèi)。（注意：凝膠一側(cè)靠 近負(fù)極，PVDF膜一側(cè)靠近正極）。電流400mA，穩(wěn)流，4°C轉(zhuǎn)移比。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出塑料支 架，依次去掉各層，用鉛筆在膜的上緣做好標(biāo)記，切下Marker上樣孔的所對(duì)應(yīng)的膜的1/2， 用麗春紅染色3s，而后用水清洗，檢查轉(zhuǎn)膜是否完全。將其余的PVDF膜放在大小合適的雜 交袋中，根據(jù)膜和袋的大小加入適量的封閉液，封口，室溫封閉比。在雜交袋上剪一小口， 小屯、取出回收封閉液，不洗膜。在不同雜交袋內(nèi)分別加入W封閉液按1 : 1000稀釋的小鼠 抗人化化ip3抗體和按1 : 2000稀釋的小鼠抗人β-actin抗體，37°C雜交lh，4°C雜交過(guò) 夜。從雜交袋中小屯、取出PVDF膜，用洗膜液振蕩洗涂3次，lOmin/次。再WTBS洗涂1次， lOmin。將PVDF膜分別與用TBST按1 : 10000稀釋的羊抗鼠二抗室溫解育化。從雜交袋 中小屯、取出PVDF膜，用洗膜液振蕩洗涂3次，lOmin/次。在EP管中中加入適量E化顯色液 A、B(1 : 1)配制好的溶液，均勻加到PVDF膜上，立即在暗室內(nèi)顯影。觀察目的條帶的變化 趨勢(shì)。
[0060] Weatern結(jié)果表明，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染了hsa-miR-874的祀基因在蛋白水平表達(dá)明 顯降低。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6B。
[00川 附：參考文獻(xiàn)
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 小分子RNAhsa-miR-874在制備治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥物中的應(yīng)用。2. 小分子RNAhsa-miR-874在制備治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。3. 小分子RNAhsa-miR-874在制備抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的小分子RNAhsa-miR-874 其核苷酸序列為：SEQIDNO. 15' -cugcccuggcccgagggaccga-3'。5. -種制備如權(quán)利要求1或2或3所述藥物的方法，其特征在于，將有效量的小分子 RNAhsa-miR-874與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，制備而得。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)研究領(lǐng)域，涉及小分子RNAhsa-miR-874在殺傷GBM中的干細(xì)胞及非干細(xì)胞腫瘤等方面的用途。主要是在制備治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥物、制備治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞藥物及制備抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明利用qRT-PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)與正常神經(jīng)干細(xì)胞相比，hsa-miR-874在GBM干細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)；與正常腦組織相比，GBM腫瘤組織中hsa-miR-874表達(dá)也下調(diào)；miR-874可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，并對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲力，腫瘤干細(xì)胞的自我更新有抑制作用，靶基因STAT3在mRNA和蛋白水平均表達(dá)下調(diào)；miR-874通過(guò)其靶基因STAT3參與了GBM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，它可作為GBM發(fā)生的調(diào)控分子，從而為臨床治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【IPC分類】A61K48/00, A61K31/7088, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105412140
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510962143
【發(fā)明人】郎明非, 孫晶
【申請(qǐng)人】大連大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年12月18日