情況。
[0034]本實驗檢測所用的引物：miR-451a化rward:5' -AAACCGUUACCAUUACUGAGUU-3'， 民everse:Uni-mi民qPC民primer; 實驗使用U6 作為內(nèi)參基因，U6Forward:5'-TACCCTGTAGATCCGAATTTGTG-3'，Reverse: 5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
[0035] 在每個樣品中分別檢測U6及miR-451a的Ct值。結(jié)果處理方法如下： (1) 計算每個樣品的Act值。
[0036] Act=Ct"R45ia-Ctue (2) 用腫瘤組織的Act值減去癌旁組織的Act值，得到ΔAct。
[ΟΟ?37]ΔΔCt二ΔCt腫瘤-ΔCt癌旁 (3) 計算2AA"值，判斷候選miR-451a在腫瘤組織中的表達情況。
[0038] 對樣品進行Solexa法測序（Solexa測序由華大基因公司完成)，測序結(jié)果顯示， miR-451a在小鼠誘導腫瘤模型中的表達量顯著降低。（圖1A) 實施例二：檢測miR-451a在人類非小細胞肺癌組織臨床樣本中的表達情況 本實例設(shè)及的41對肺癌及癌旁組織皆來自于上海市胸科醫(yī)院。
[0039] 本實例使用實施例一中的Trizol法提取組織的總RNA，并WTakara公司的化e StepPrimeScriptmiRNAcDNASynthesisKit(CodeNo.D350A)進行逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建上述 組織的cDNA文庫，Woligo化為引物進行逆轉(zhuǎn)錄，通過變性反應和逆轉(zhuǎn)錄2步獲得后續(xù)實 驗所需的miRNAcDNA文庫。
[0040] 研究發(fā)現(xiàn)，將41例病例組織按照?M分期進行分類，在N0M1分組中，miR-451a表 達水平相較于癌旁組織下降到30.64%，并且顯著性較好？<0.01(口￥曰1116= 0.0036)。（圖 1B) 實施例Ξ:檢測常見肺癌細胞系中miRNA的表達差異 常見肺癌細胞系包括：A549、H1299、Spca-1、Hcc827、95-D等，其中，A549、Hcc827為人 非小細胞肺癌細胞，Spca-1為人肺腺癌細胞，H1299為非小細胞肺癌上皮樣細胞，95-D為人 高轉(zhuǎn)移性肺癌細胞。本實例W正常肺上皮細胞Beas-2B為參照，同時培養(yǎng)上述5種肺癌細 胞系。細胞培養(yǎng)按照ATCC標準流程進行，分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的對應培養(yǎng)基中。細 胞培養(yǎng)箱保持濕潤，維持5%C〇2的培養(yǎng)狀態(tài)，W37°C培養(yǎng)細胞。
[0041] 當細胞在6cm培養(yǎng)皿中達到約80%密度時，使用實施例一中的Trizol法抽提細胞 RNA，并使用實例一中的cDNA逆轉(zhuǎn)錄方法與qRT-PCR檢測法檢測miR-45la在常見人類非小 細胞肺癌細胞系中的表達情況。
[0042]研究結(jié)果顯示，WBeas-2B為參照，miR-451a在A549、H1299、Spca-l、Hcc827、95-D 細胞系中表達量均有所下降（圖1C)。
[004引實施例四：miR-45la對A549細胞遷移的影響 將A549細胞均勻地鋪在6孔板中，使用的培養(yǎng)基為DMEM。細胞培養(yǎng)24hours后使用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑，將NC、miR-451amimics通過無血清培養(yǎng)液的共解育后轉(zhuǎn)入A549細胞 中。
[0044] 轉(zhuǎn)染步驟具體如下：（1)轉(zhuǎn)染前一天，接種適當數(shù)量的細胞至培養(yǎng)板中，每孔加入 不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度能夠達到50%。（2)準備mimic-lipo2000混合 液：a.稀釋miRNAmimic:用50μ1不含血清培養(yǎng)基DMEM稀釋miRNAmimics,使加入細胞 中的終濃度為60nmol/L輕輕混勻，室溫解育5min;b.稀釋lipo2000:用50μ1不含血清 的DMEM稀釋1μ1lipo2000,輕輕混勻并室溫解育5min;c.將a與b輕輕混勻，室溫解育 20min。（3)將miRNA-mimics-lipo2000混合液加入含有細胞及培養(yǎng)液的培養(yǎng)孔中，輕輕 混勻；（4)將培養(yǎng)板置于37 °C的C〇2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)化后，將孔里含有mimics-lipo2000 混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基。
[0045] 轉(zhuǎn)染后，待細胞密度達到100%時，使用滅菌的槍頭比著直尺均勻劃痕，并做好相 應的標記。然后，用PBS洗去漂浮的細胞，加入新的培養(yǎng)基。隨后，放入37°C5%C〇2培養(yǎng) 箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24hours后取出樣品，使用倒置顯微鏡觀察同一區(qū)域細胞的生長狀態(tài)，檢測 miR-451a對于細胞遷移的影響。進行Ξ組重復試驗。
[0046] 實驗結(jié)果顯示，相較于對照組，過表達miR-451a顯著地抑制了A549細胞的遷移 (圖 2)。
[0047] 實施例五：雙巧光素酶報告基因系統(tǒng)分析 將CAB39mRNA的3 '-UTR(482bp)克隆到pGk3質(zhì)粒上，該質(zhì)粒含有SV40的啟動 子，CAB39的3' -UTR區(qū)域包含了miR-451a與之結(jié)合的位點。使用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑將 miR-451amimics與構(gòu)建好的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入肥K-293T細胞中，并同時轉(zhuǎn)入郵L質(zhì)粒作為背景 信號，轉(zhuǎn)染6hours后更換新鮮培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48hours后，采用Promega公司的雙巧光素酶 報告基因系統(tǒng)分析試劑盒檢測P化和郵L的巧光表達情況。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的終濃度為400nmol/ LmiRNAmimics的終濃度為20nmol/L。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR-451a的肥K-293T細 胞中，雙巧光素酶的表達顯著低于對照組。隨后，利用突變試劑盒構(gòu)建CAB393' -UTR的點 突變，用lip〇2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-451amimics與構(gòu)建好的點突變質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入肥K-293T細 胞中。轉(zhuǎn)染48hours后，采用Promega公司的雙巧光素酶報告基因系統(tǒng)分析試劑盒檢測， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-451a的肥K-293T細胞中，雙巧光素酶的表達量較對照組沒有顯著變 化。
[0048] 上述實驗結(jié)果都證明了CAB39為miR-451a的祀基因（圖3B)。
[0049] 實施例六：WesternBlot驗證miR-451a對于A549細胞內(nèi)源CAB39基因的抑制作 用 將A549細胞均勻地鋪在6孔板中，每個樣品Ξ次重復。細胞培養(yǎng)24hours后，分別轉(zhuǎn) 染miR-451amimics和NC。48hours后收集、裂解細胞，并定量各樣品中的蛋白含量。定 量蛋白采用Lowry法，使用CAB39的多抗進行檢測，該抗體由ABclonal公司生產(chǎn)。本實驗 采用12%SDS-PA(iE膠進行蛋白電泳，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜緩沖液和 膜清洗液的配制均參照分子克隆。CAB39蛋白的抗體按照1:800稀釋，GAPDH蛋白的抗體按 照1:1000稀釋。所采用的二抗帶有HRP標記，按照1:10000稀釋。采用Milipore的化學 發(fā)光劑顯色。
[0050]WesternBlot實驗結(jié)果表明，miR-451a對于A549細胞內(nèi)源CAB39基因有抑制作 用（圖3C)。
[0051] 實施例屯：檢測單轉(zhuǎn)miR-451a、單轉(zhuǎn)CAB39,W及共轉(zhuǎn)miR-451a與CAB39對于A549 細胞遷移作用 使用Corning公司生產(chǎn)的8.Oum孔徑hanswell小室（CodeNo. 3422)，檢測miR-451a和CAB39對于細胞縱向遷移能力的影響?；痑nswell小室的底層是一張具有通透 性的聚碳酸醋膜，在上室中接種腫瘤細胞，而在下室加入胎牛血清或某些特定的趨化因子， 腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室遷移，通過計數(shù)進入下室的細胞量即可反映腫瘤細胞的遷 移能力。
[0052] 實驗的具體操作步驟為：（1)將A549細胞均勻地鋪在6孔板中，每個樣品Ξ次重 復。細胞培養(yǎng)24hours后，分別共轉(zhuǎn)miR-451a-pEGFP(綠光）和CAB39-pmCher巧（紅光）， W及祀GFP、pmChe;r;ry^gativeControl。轉(zhuǎn)染 24hours后，使用Bio-Rad細胞計數(shù)儀計數(shù) 細胞，每個化answell小室中初始接種5X104個細胞，上室中使用0. 5%FBS濃度的DMEM培 養(yǎng)基，下室則使用10%FBS濃度的DMEM培養(yǎng)基。（2)繼續(xù)培養(yǎng)24hours后，收集Transwell 小室內(nèi)培養(yǎng)基放入離屯、管A;取出化answell小室，用PBS清洗小室外側(cè)，清洗液和下層培 養(yǎng)基一起收集到離屯、管B。（3)用膜酶消化附著于24孔板上的細胞，合并收集到離屯、管B; 同時膜酶消化膜上層細胞，合并收集到離屯、管A。（4)通過Bio-Rad細胞計數(shù)儀計數(shù)離屯、管 A、B中的細胞，其中離屯、管A為全部的上層細胞，離屯、管B為全部的下層細胞。（5)通過流 式細胞儀檢測離屯、管A、B中的細胞：獲得單轉(zhuǎn)miR-451a-pEGFP、單轉(zhuǎn)CAB39-pmCherry，W及 共轉(zhuǎn)miR-451a-pEGFP與CAB39 -pmCher巧的細胞占總細胞量的比例。
[0053] 該實驗操作最大限度的避免了細胞增殖對于遷移的潛在影響，因而提供了更加真 實可信的細胞遷移實驗結(jié)果?；痑nswellAssay實驗結(jié)果表明，miR-451a能夠有效地回復 由CAB39引起的細胞遷移能力增強，并且在調(diào)節(jié)細胞遷移中發(fā)揮重要作用（圖4A、B、C)。
[0054] 盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的， 即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利 要求覆蓋了所有運些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。
【主權(quán)項】
1. 一種miR-451a制備調(diào)控下游靶基因CAB39表達藥物中的應用。2. -種miR-451a基因在制備抑制非小細胞肺癌迀移藥物中的應用。3. -種miR-451a基因在制備非小細胞肺癌靶標藥物的應用。4. 一種miR-451a基因在制備治療或預防CAB39基因異常表達的非小細胞肺癌藥物中 的應用。5.如權(quán)利要求4所述的用途，一種miR-451a基因在制備治療或預防CAB39基因異常 表達的非小細胞肺癌的組合物或試劑盒中的用途。 6. miR-451a抑制劑為miR-451a的反義核酸，在制備治療或預防CAB39基因異常表 達的非小細胞肺癌藥物中的應用。7.如權(quán)利要求6所述的用途，miR-451a抑制劑在制備治療或預防CAB39基因異常 表達的非小細胞肺癌的組合物或試劑盒中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及miR-451a細胞在非小細胞肺癌中的作用。miR-451a在A549細胞中過表達miR-451a能夠顯著地抑制A549細胞遷移。利用生物信息學分析手段，預測到miR-451a通過與靶基因CAB39？mRNA的3′-UTR區(qū)域互補，從而抑制了靶基因mRNA的翻譯或直接降解靶基因的mRNA，經(jīng)過雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)分析和Western？Blot實驗驗證，確定CAB39基因為miR-451a的靶基因。最終，借助Transwell？Assay和Flow？Cytometry？Assay實驗手段，證實了miR-451a在A549細胞中通過下調(diào)CAB39基因發(fā)揮抑制細胞遷移的功能，提供一種新穎的精準治療研究及治療方案。該發(fā)明在臨床上，為利用miRNA來診斷和治療非小細胞肺癌，尋找藥物靶點以及在腫瘤免疫治療等領(lǐng)域提供了重要的研究指導和應用價值。
【IPC分類】A61K48/00, A61P35/00, A61P35/04
【公開號】CN105412944
【申請?zhí)枴緾N201510904332
【發(fā)明人】金由辛, 金言, 王強, 黨啟, 李雪
【申請人】上海大學
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月9日