損傷區(qū)域(圖6-D)的Gomori三色染色；纖維組織染色成翠藍色(turquoise blue)。圖6_E.老年主體脂肪骨髓腔及接受L-Wnt3a處理的老年骨移植物的鄰近損傷區(qū)域(圖6-F)的Gomori三色染色；成熟骨樣基質(zhì)染色成深藍綠色(dark turquoise)和骨細胞核染色成紅色。圖6_G.在偏振光下，天狼猩紅染色鑒別由用L-PBS處理的老年骨移植物形成的纖維組織。與用L-Wnt3a處理的老年骨移植物所形成的骨樣基質(zhì)(圖6-H)相比較?？s寫:L-PBS =脂質(zhì)體PBS和L_Wnt3a=脂質(zhì)體Wnt3a。箭頭標(biāo)明完整骨骼的邊緣。標(biāo)尺:50(^111(圖64和6-8) ;100μπι(圖6-C至 6-F)和 200 μ m (圖 6-G 和 6_H)。
[0019]圖7.骨移植物材料包含干細胞和祖細胞群體。從大鼠股骨(A)、⑶髂嵴和(C)脛骨收獲的BGM的Gomori染色。(D)從所示來源新收獲的大鼠BGM中內(nèi)源成骨基因表達的定量RTPCR分析。(E)實驗設(shè)計的示意圖，其中自體BGM移植到大鼠SRC中。(F)移植后第7天髂嵴BGM的代表性組織切片，經(jīng)染色以檢測BrdU摻入。點線指示BGM中包括的松質(zhì)骨片。(G)Runx2、(H)Sox9和(I)PPARy表達。(J)BGM的代表性組織切片用苯胺藍染色以檢測骨樣基質(zhì)；星號指示與老骨碎片(黃色點線)相反的新骨基質(zhì)。腎表面在該圖中和在G中用白色點線指示。(K)番紅0/快綠組織學(xué)以檢測富含蛋白聚糖的軟骨(紅色)，和(L)Gomori三色染色以檢測脂肪細胞。縮寫:BrdU,溴脫氧尿苷；PPARy,過氧物酶體增殖物活化蛋白γ。標(biāo)尺:50 μ m，星號:ρ〈0.05。
[0020]圖8.骨移植物材料是Axin2&eERT2;R26m TmG小鼠中的Wnt反應(yīng)性GFP+ve細胞，骨膜(A)和骨內(nèi)膜(B)通過免疫染色可視化。(C)指定的顯微鏡視野內(nèi)GFP+TC細胞/總細胞的定量。⑶BGM中的GFP+ve細胞通過熒光可視化。(E) BGM (綠色條)和(灰色條)中內(nèi)源Axin2、Lef 1和GAPDH表達的定量絕對RT-PCR結(jié)果。(F) BGM雜(綠色條)和BGM老?(灰色條)中Wnt3a、總β連環(huán)蛋白、Axin2和β肌動蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。標(biāo)尺=50 ym。星號:ρ〈0.05。
[0021]圖9.BGM的成骨分化潛能隨年齡下降。(A)BGM#5 (綠色條)和BGM^5.(灰色條)中堿性磷酸酶、Osterix和骨鈣蛋白表達的定量RT-PCR分析。從ACTB_eGFP小鼠收獲的BGM，移植到SRC中并在亮視野⑶和(C)熒光下可視化以檢測BGM中的GFP信號。來自(D)BGM#5 (N = 5)和(E)BGM^^ (N = 5)的用苯胺藍(插圖)染色的代表性組織切片。點線指示表面。(F)在移植后第7天BGM占據(jù)的總區(qū)域內(nèi)苯胺藍像素的組織形態(tài)測定分析。來自(G)BGM#5 (N = 5)和(N = 5)的經(jīng)染色以檢測ALP活性的代表性組織切片。(I)在移植后第7天BGM占據(jù)的總區(qū)域內(nèi)ALP+ve像素的定量。來自(J)BGM@(N =5)和OOBGM^5.(N = 5)的對于GFP免疫染色的代表性組織切片。(L)在移植后第7天BGM占據(jù)的總區(qū)域內(nèi)GFP+VE像素的定量。縮寫:ALP，堿性磷酸酶；0c，骨鈣蛋白。標(biāo)尺:100 μπι。星號:ρ〈0.05 ;雙星號:ρ〈0.01。
[0022]圖10.BGM的成骨分化需要內(nèi)源Wnt信號。用㈧鼠IgG2 a Fc片段(Ad_Fc)或(Β)表達可溶性Wnt拮抗劑Dkkl的腺病毒(Ad-Dkkl)處理的BGM中對于ALP活性進行染色的代表性組織切片。用(C)Ad-Fc或(D) Ad-Dkkl處理的BGM中對于PPARy免疫染色的代表性組織切片。用(E)Ad-Fc或(F) Ad-Dkkl處理的BGM中對于Dlkl免疫染色的代表性組織切片。檢測接受用(G)Ad-Fc或⑶Ad-Dkkl處理的BGM的缺陷位點中骨形成的微-CT重建。原始缺陷用點狀紅色圓圈指示。(I)從微-CT數(shù)據(jù)土SEM計算的新骨體積(N = 5)。來自接受用(J)Ad-Fc或(K)Ad-Dkkl處理的BGM的缺陷位點的代表性組織切片的苯胺藍染色。(L)使用組織形態(tài)測定分析的新骨體積定量(參見方法)。用(I)Ad-Fc或(J) Ad-Dkkl處理的BM移植物中的 PPAR-γ 表達。單一星號:p<0.05。標(biāo)尺:A-B, 200 μ m, CF, J-K, 50 μ m, G-H, 2mm。
[0023]圖11.Wnt3a激活BGM^^并恢復(fù)其成骨分化潛能。㈧來自老年ACTB_eGFP小鼠的BGM，用L-PBS或L-WNT3A (0.15 μ g/ml)處理lh，然后通過qRT-PCR測定24h后靶基因表達或立即移植到SRC中7天。(B)用L-PBS(灰色條)或L_WNT3A(藍色條)處理的BGM*.中Axin2和Lefl表達的倍數(shù)變化。(C)用L_PBS(灰色條)或L_WNT3A(藍色條)處理的BGM^^中總β連環(huán)蛋白、Axin2和β肌動蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。在移植后第4天從SRC收獲BGM—后，來自(D)L-PBS(N = 5)和(E) L-WNT3A的代表性組織切片對于BrdU摻入進行染色(N = 5)。(F)中心定位于骨移植物中間的顯微鏡視野內(nèi)BrdU+ve像素的定量。來自(G)L-PBS(N = 5)和(H)L-WNT3A(N = 5)處理的樣品的代表性組織切片，在移植后第7天對于BrdU摻入進行染色。(I)如上BrdU+ve像素的定量。來自(J)L-PBS(N = 5)和(K)L-ffNT3A(N = 5)處理的樣品的代表性組織切片，在移植后第7天對于Dlkl表達進行免疫染色。(L)在移植后第7天BGM占據(jù)的總區(qū)域內(nèi)Dlkl+ve像素的定量。來自(M) L-PBS (N = 5)和(K)L-WNT3A(N = 5)處理的樣品的代表性組織切片，在移植后第7天對于Oc表達進行免疫染色。(0)如對于Dlkl描述的0c+ve像素的定量。(P)L-PBS(N = 5)和(Q)L-ffNT3A(N =5)處理的樣品中用苯胺藍染色以檢測骨樣基質(zhì)的代表性組織切片。(R)新骨基質(zhì)的組織形態(tài)測定定量；詳細信息參見方法。縮寫如之前圖例中。標(biāo)尺:100μπι。星號:ρ〈0.05;雙星號:ρ<0.01。
[0024]圖12.L-WNT3A刺激BGM干細胞并改善脊柱融合。(A)人MSC培養(yǎng)物在37°C下用L-PBS或L-WNT3A處理所示的時間點，且Axin2表達的qRTPCR用于測定Wnt-反應(yīng)。(B)鼠SSC在37°C下用L-PBS或LWNT3A處理12h，且Wnt反應(yīng)用Axin2表達的qRT-PCR進行分析。
(C)響應(yīng)于室溫下L-PBS(虛線)或L-WNT3A(0.15 μ g/mL ;藍色線)lh孵育的Axin2和Lefl表達的定量絕對RT-PCR分析。數(shù)據(jù)表示為24h時間段內(nèi)RNA拷貝/總RNA含量的比率。
(D)大鼠棘突通過最小切口暴露，且來自髂嵴的標(biāo)準(zhǔn)化體積的自體BGM用L-PBS或L-WNT3A處理lhr，然后(E)移植在L4和L5脊椎骨的橫突之間。在P0D2時，對于用(F)L_PBS和(G) L-WNT3A處理的圖形(粉紅色)進行微-CT探測(acquisit1n)。在P0D49時，再次進行微-CT探測以評估用(H) L-PBS (灰色)和(I) L-WNT3A (藍色)處理的移植物的骨生長。
(I)移植物生長作為倍數(shù)體積對于各處理組作圖，將P0D2時的各移植物尺寸與其P0D49時的尺寸(如上所述通過顏色指示)相比較?？s寫:L4，腰椎#4，L5，腰椎#5，AP，頂突，SP，棘突，TP，橫突，P0D，手術(shù)后天。
【具體實施方式】
[0025]定義
[0026]在描述本方法之前，要理解本發(fā)明不限于所描述的特定方法，因此其當(dāng)然可以是變化的。也應(yīng)理解本文中使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方式的目的，且不意圖是限制的，因為本發(fā)明的范圍僅由所附的權(quán)利要求限定。在提供值的范圍的情況中，應(yīng)理解在該范圍的上限和下限之間的中間值(到下限值的十分之一單位，除非上下文明確指定另外的情況)及在該指定范圍中的任何其它指定的或中間的值包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在本發(fā)明涵蓋的較小范圍內(nèi)，但服從于指定范圍中任何特別地排除的限制。除非另外限定，本文中使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。Singleton等，Dict1nary of Microb1logy and MolecularB1logy 2nd ed., J.ffiley&Sons (New York, NY 1994)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本申請中使用的許多術(shù)語的一般指導(dǎo)。
[0027]本文中提及的所有出版物通過引用明確并入本文以公開和描述與引用該出版物相關(guān)的方法和/或材料。
[0028]Wnt蛋白。Wnt蛋白形成高度保守的分泌信號分子的家族，其在胚胎發(fā)生過程中調(diào)節(jié)細胞-細胞相互作用。術(shù)語“Wnt”或“Wnt基因產(chǎn)物”或“Wnt蛋白”或“Wnt多肽”可互換使用并包括原始序列Wnt多肽、Wnt多肽變體、Wnt多肽片段和嵌合Wnt多肽。在本發(fā)明的一些實施方式中，Wnt蛋白包含與半胱氨酸殘基共價結(jié)合的棕櫚酸酯?！霸夹蛄小倍嚯氖蔷哂信c天然來源的Wnt多肽相同的氨基酸序列的多肽，無論用于其產(chǎn)生的方法。這樣的原始序列多肽可以從產(chǎn)生內(nèi)源Wnt蛋白的細胞分離或可以通過重組或合成方式產(chǎn)生。因此原始序列多肽可以具有例如天然存在的人多肽、鼠多肽或者來自任何其它哺乳動物物種或來自非哺乳動物物種(例如果蠅、秀麗隱桿線蟲等)的多肽的氨基酸序列。
[0029]術(shù)語“原始序列Wnt多肽”包括，但不限于，人和鼠Wnt多肽。人Wnt蛋白包括以下:Wntl，Genbank 參考號 NP005421.1 ;Wnt2, Genbank 參考號 NP003382.1，其在腦中在丘腦中、在胎兒和成人的肺中和在胎盤中表達；Wnt2B的兩種異形體，Genbank參考號NP004176.2和NP078613.1。異形體1在成人心臟、腦、胎盤、肺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸和結(jié)腸中表達。在成人腦中，它主要在尾狀核、丘腦底核和丘腦中發(fā)現(xiàn)。也在胎兒腦、肺和腎中檢測到。異形體2在胎兒腦、胎兒肺、胎兒腎、尾狀核、睪丸和癌細胞系中表達。Wnt 3和Wnt3A在發(fā)育神經(jīng)管的形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮明顯的細胞-細胞信號傳導(dǎo)作用，并分別具有Genbank參考號 NP11 0380.1 和 X56842(Swiss-Prot P56704)。
[0030]原始人Wnt3A氨基酸和核苷酸序列分別特別地公開為SEQ ID NO: 1和2。Wnt3A在骨髓中表達。Wnt 4具有Genbank參考號NP110388.2。Wnt 5A和Wnt 5B具有Genbank參考號 NP003383.1 和 AK013218。Wnt 6 具有 Genbank 參考號 NP006513.1 ；ffnt 7A 在胎盤、腎、睪丸、子宮、胎兒肺及胎兒和成人腦中表達，Genbank參考號NP004616.2。Wnt 7B在胎兒腦中中度表達，在胎兒肺和腎中弱表達，且在成人腦、肺和前列腺中微弱表達，Genbank參考號NP478679.1。Wnt 8A 具有兩個選擇性轉(zhuǎn)錄本(alternative transcript)，Genbank 參考號NP114139.1 和 NP490645.loffnt 8B 在前腦中表達，并具有 Genbank 參考號 NP003384.loffnt10A具有Genbank參考號NP079492.2。Wnt 10B在大多數(shù)成人組織中檢測到，在心臟和骨骼肌中具有最高水平。它具有Genbank參考號NP003385.2。Wnt 11在胎兒肺、腎、成人心臟、肝臟、骨骼肌和胰腺中表達，并具有Genbank參考號NP004617.2。Wnt 14具有Genbank參考號NP003386.1。Wnt 15在胎兒腎和成人腎中中度表達，且也在腦中發(fā)現(xiàn)。它具有Genbank參考號NP003387.1。Wnt 16具有兩個異形體，Wnt_16a和Wnt_16b，其通過可變剪接產(chǎn)生。異形體Wnt-16B在外周淋巴器官如脾、闌尾(appendix)和淋巴結(jié)中、在腎中表達，但不在骨髓中表達。異形體Wnt-16a僅在胰腺中以顯著水平表達。Genbank參考號是NP057171.2和NP476509.1。所列舉的全部GenBank、SwissProt和其它數(shù)據(jù)庫序列在此明確通過引用并入。
[0031]術(shù)語“原始序列Wnt蛋白”或“原始序列Wnt多肽”包括具有或不具有起始N-末端甲硫氨酸(Met)和具有或不具有原始信號序列的原始蛋白質(zhì)。該術(shù)語特別地包括352氨基酸長的原始人Wnt3a多肽，具有或不具有其N-末端甲硫氨酸(Met)和具有或不具有原始信號序列。
[0032]“變體”多肽是指與原始序列多肽具有低于100%的序列同一性的，如下定義的生物活性多肽。這樣的變體包括其中一個或多個氨基酸殘基添加到原始序列的N-或C-末端或者原始序列內(nèi)；大約一至四十個氨基酸殘基被刪除和任選地被一個或多個氨基酸殘基置換的多肽，及上述多肽的衍生物，其中氨基酸殘基被共價修飾以使得所得產(chǎn)物具有非天然發(fā)生的氨基酸。通常，生物活性Wnt變體的氨基酸序列與原始序列Wnt多肽具有至少約90%氨基酸序列同一性，優(yōu)選至少約95%，更優(yōu)選至少約99%。
[0033]“嵌合"Wnt多肽是包含與異源多肽融合或結(jié)合的Wnt多肽或其部分(例如，一個或多個結(jié)構(gòu)域)的多肽。嵌合Wnt多肽一般與原始序列Wnt多肽共有至少一種共同的生物學(xué)性質(zhì)。嵌合多肽的實例包括免疫粘附素，將Wnt多肽的一部分與免疫球蛋白序列結(jié)合，和附加表位的多肽，其包含與“標(biāo)簽多肽”融合的Wnt多肽或其部分。標(biāo)簽多肽具有足夠的殘基以提供可以針對其產(chǎn)生抗體的表位，且還足夠短以使得其不干擾Wnt多肽的生物活性。合適的標(biāo)簽多肽一般具有至少六個氨基酸殘基且通常約6-60個氨基酸殘基。
[0034]原始序列Wnt多肽的“功能性衍生物”是具有與原始序列Wnt多肽共同的定性生物學(xué)性質(zhì)的化合物。“功能性衍生物”包括，但不限于，原始序列的片段和原始序列Wnt多肽及其片段的衍生物，條件是它們具有與對應(yīng)的原始序列Wnt多肽共同的生物學(xué)性質(zhì)。術(shù)語“衍生物”涵蓋Wnt多肽的氨基酸序列變體及其共價修飾。
[0035]生物活性Wnt。本發(fā)明的方法提供在體內(nèi)施用于動物(例如，哺乳動物，如人)時為活性的Wnt組合物?？梢酝ㄟ^在功能性分析(例如，體外分析)中或在測試模型(例如，加速骨再生、干細胞增殖的上調(diào)等)中體內(nèi)施用后測定活性水平、在非功能性分析(例如，免疫染色、ELISA、考馬斯或銀染凝膠上的定量等)中定量存在的Wnt蛋白量和測定體內(nèi)生物活性Wnt與總Wnt的比率來測定Wnt蛋白的比活性。
[0036]脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。如本發(fā)明的方法中使用的，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)在體內(nèi)施用后維持Wnt蛋白的活性方面是重要的。Wnt蛋白未包封在這些結(jié)構(gòu)的水相中，而是相反整合到脂質(zhì)膜中，且可以插入膜的外層中。這樣的結(jié)構(gòu)不是從例如脂