抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的IgE抗體的制作方法
【專利說明】抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的IgE抗體
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2013年6月12日提交的美國臨時申請No.61/834,169的權(quán)益，W及2013 年7月11日提交的美國專利申請No. 13/939，781的權(quán)益。W上申請的全部教導(dǎo)內(nèi)容整體W引 用方式并入本文。
[0003] 政府支持
[0004] 本發(fā)明的作出得到了政府支持，具體為由美國國立衛(wèi)生研究院（National InstitutesofHealth)資助的第CA111639號合同。政府在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[000引I姐抗體介導(dǎo)過敏和哮喘反應(yīng)，運些反應(yīng)的特征在于需要募集效應(yīng)細(xì)胞的速發(fā)型 超敏和炎癥延遲型應(yīng)答。I巧抗體從外周循環(huán)轉(zhuǎn)運到組織中，在那里它們可經(jīng)由W下Ξ種類 型的化受體而結(jié)合過敏效應(yīng)細(xì)胞，諸如肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、 朗格漢斯細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨隧細(xì)胞:FceRK或高親和力化eRKKa=l0iiM-i)、FceRII(或低 親和力化eR，CD23KKa<l08M-i)和半乳凝素-3。不同于IgG類抗體，I巧W極高的親和力結(jié)合 到其化R，該親和力就化eRI而言比IgG對化R(Fc丫RI-III)的親和力高大約Ξ個數(shù)量級，且 就FcεRII而言，與IgG對其高親和力Fc丫RI的親和力一樣高（Gould，HJ，etal.， Annu.Rev.Immunol21:579-628.(2003);Gounni,AS,etalNature,367:183-186 (1994);Kinet,JP,Annu.Rev.Immunol.,17:931-72:931-972(1999)和RavetchJV,and KinetJP,Annu.Rev.Immunol.,9:457-492(1991))0
[0006]過敏腫瘤學(xué)(AllergoOncology)新出現(xiàn)的領(lǐng)域基于表明IgE介導(dǎo)的過敏與癌癥之 間存在逆相關(guān)性的觀察結(jié)果和研究（TurnerMC，etal.Jnt.J.Cancer,118 :3124-3132 (2006)；WangH&DiepgenTL,Allergy60:1098-1111,(2005)；TurnerMC,etal., Am.J.Epidemiol.,162:212-221(2005)；WangH,etal.,Int.J.Cancer,119:695-701 (2006)；MillsPK,etal.,Am.J.Epidemiol.,136:287-295(1992)；WiemelsJL,etal., (MincerRes.,64:8468-8473(2004);DodigS.,etal.,ActaPharm.,55:123-138(2005)和 WrenschM.,etal.,CancerRes.,66:4531-4541(2006))。因此，該領(lǐng)域的研究人員正在探 索I巧抗體類在W下前提下在預(yù)防和治療某些癌癥中的治療潛力:最初作為對微生物/寄生 蟲感染的適應(yīng)性反應(yīng)而發(fā)生的免疫反應(yīng)在抗惡性腫瘤時可能是有用的。
[0007] IgE在癌癥治療方面的應(yīng)用由Nagy等人倡導(dǎo)（Nagy，E.，etal.，Cancer Immunol.Immunother.，34:63-69(1991))，他們開發(fā)了對小鼠乳瘤病毒(MTV)的大囊膜糖 蛋白（gp36)具有特異性的鼠I姐單克隆抗體并證實了在具有同基因MMTV分泌性乳腺腺癌 (H27 12)的C3H/HeJ小鼠中的顯著抗腫瘤活性（Nagy，E.，etal.，Cancer Immunol.Immunother. ,34:63-69 (1991))oKershaw等人(Kershaw,ΜΗ,etal. ,Oncol.Res., 10:133-142(1998))開發(fā)了名為30.6的鼠單克隆IgE,其為在結(jié)直腸腺癌細(xì)胞表面上表達(dá)的 抗原決定簇特異性的。小鼠I姐30.6抑制了在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID)小鼠中的皮下生長 的既定人結(jié)直腸癌COLO205細(xì)胞的生長，但運種效應(yīng)是短暫的。相比之下，小鼠IgG30.6未 顯示出抗腫瘤效應(yīng)。小鼠I巧的特定效果歸因于該抗體與具有FceR的效應(yīng)細(xì)胞之間的相互 作用，因為該活性具體地通過事先施用非特異性小鼠I扣而喪失化ershaw，MH，etal.， Oncol.Res.，10:133-142(1998))eGould等人開發(fā)了卵巢癌腫瘤相關(guān)抗原葉酸鹽結(jié)合蛋白 (FBP)特異性的小鼠/人嵌合IgE(MOvlS-IgE)和IgGMOvlS(IgGl)。在人卵巢癌SCID小鼠異 種移植模型（IGR0V1)中對MOvlS-I巧和M0vl8-IgGl的保護(hù)活性進(jìn)行了比較。MOvlS-I巧的有 益效果大于M0vl8-IgGl且持續(xù)時間更長，從而證實了I姐抗體優(yōu)異的抗腫瘤效果(Gould, 町，etal.'Eur.J.Immunol.,29:3527-3537(1999))。
[0008]近來，Karagiannis等人證實了單核細(xì)胞通過兩種不同的途徑介導(dǎo)IgE依賴性腫瘤 細(xì)胞殺傷:ADCC(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)和ADCP(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞隧作 用），運兩種途徑通過FceRI和FceRII介導(dǎo)（Karagiannis,SN,etalCancer Immunol.Immunother.,57:247-263(2008)和Karagiannis,SN,etal.,J.Immunol.,179: 2832-2843(2007))。該小組還使用運種測定系統(tǒng)證實了抗化巧可激活單核細(xì)胞而經(jīng)由 ADCC在體外殺傷腫瘤細(xì)胞化arragiannisP.,etal.,(MincerImmunol.Immunother.,58: 915-930(2009) ,2008年10月22日在線出版）。另外的實例包括化等人(Clin.Exp.Immunol.， 153:401-409，2008)，他們證實了從膜腺癌患者分離的I姐類抗體介導(dǎo)對抗癌細(xì)胞的ADCC， W及Spillner等人(CancerImmunol.Immunother. ,61:1565-1573(2012)，他們展示了使用 單核細(xì)胞，在體外與抗EGFRIgG相比，抗EGFRI巧將對抗人上皮癌細(xì)胞系A(chǔ)431的細(xì)胞毒性 提高了高達(dá)95 %。
[0009]盡管在過敏腫瘤學(xué)的新興領(lǐng)域中出現(xiàn)了鼓舞人屯、的發(fā)現(xiàn)，但是仍然迫切需要開發(fā) 治療轉(zhuǎn)移癌的新型治療劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了可用于抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的新型I姐抗體。提供了具有對腫瘤相 關(guān)抗原(TAA)的結(jié)合特異性的包含人ε恒定區(qū)和可變區(qū)的治療性單克隆I姐抗體。還提供了 對位于原發(fā)性實體瘤微環(huán)境中的至少一種宿主源非腫瘤細(xì)胞的活性重編程的方法，從而逆 轉(zhuǎn)該非腫瘤細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的能力。提供了治療患者中的轉(zhuǎn)移癌、抑制原發(fā)性腫 瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和減緩原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長動力學(xué)的方法。
[0011] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了對位于患者實體瘤的微環(huán)境中的至少一種宿主 源非腫瘤細(xì)胞的活性重編程的方法，其中非腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的能力受到抑制，該方 法包括施用腫瘤相關(guān)抗原特異性的I姐抗體的步驟，其中抗體在腫瘤的微環(huán)境內(nèi)形成Ξ元 復(fù)合物，所述Ξ元復(fù)合物由I巧抗體、腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤環(huán)境內(nèi)源性的宿主源非腫瘤細(xì)胞 構(gòu)成，其中抗體特異性結(jié)合到腫瘤相關(guān)抗原和位于宿主源非腫瘤細(xì)胞的表面上的抗體受 體，該抗體受體為I巧特異性的。
[0012] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供抑制患者中的實體瘤轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括 向患者施用能夠在腫瘤的微環(huán)境內(nèi)形成Ξ元復(fù)合物的I巧抗體，所述Ξ元復(fù)合物由腫瘤相 關(guān)抗原特異性的I巧抗體、腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤微環(huán)境內(nèi)源性的宿主源非腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，其 中抗體特異性結(jié)合到腫瘤相關(guān)抗原和位于宿主源非腫瘤細(xì)胞的表面上的抗體受體，該抗體 受體為I巧特異性的，并且其中在形成Ξ元復(fù)合物后，非腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的能力受到 抑制。
【附圖說明】
[0013]前述的W及其他的目標(biāo)、特征和優(yōu)點會從W下的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案的更具 體的描述中更明顯地表現(xiàn)出來，如附圖所示，在不同的視圖中，相似的字母對應(yīng)相同的部 件。附圖并不一定是按照比例制作的，而是在強調(diào)表現(xiàn)本發(fā)明的原理。
[0014]圖1.嵌合I姐抗體的構(gòu)造和抗原特異性。（A)載體構(gòu)建體的圖形表示。親代載體為 pcDNA3.1/新霉素（pEpsilonI)、pEF6/滅攝素（pEpsilonII)、pcDNA3.1/博萊霉素 (pKappaI)和pcDNA3.1/潮霉素(pKappaII)。重鏈和輕鏈可變區(qū)基因從表1中的雜交瘤克 隆，并插入人ε或人k恒定區(qū)基因的上游。（B)SDS-PAGE分析。從轉(zhuǎn)染的CH0-K1克隆純化的嵌 合I姐W及得自骨髓瘤細(xì)胞系SK0-007的對照人I巧通過電泳在4-12%梯度丙締酷胺凝膠上 分離，并通過考馬斯藍(lán)染色。（C)抗體特異性分析。疊加柱狀圖示出了與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系相 比，結(jié)合到用同族抗原轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的I姐的FACS分析。1巧.higE(抗hCD20)結(jié)合了用人 CD20cDNA轉(zhuǎn)染的A20細(xì)胞，而3C6.hI巧(抗hMUC1，部分糖基化的形式)在用hMUC1cDNA轉(zhuǎn)染的 小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T-1上檢測到人MUC1。折線圖顯示了通過4冊.hi姐(抗hMUCl蛋白骨架） 對合成的hMUCl串聯(lián)重復(fù)膚（50mer)的ELISA檢測。對照膚源自hCD20的第二個胞外環(huán) (43mer)。
[001引圖2.肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的體外腫瘤細(xì)胞毒性。柱狀圖顯示％PrCFSE+ 腫瘤細(xì)胞。將0CI-Ly8人B細(xì)胞淋己瘤細(xì)胞化CD20+)用l0-5mMCFSE標(biāo)記15分鐘。將lXl05個 標(biāo)記的細(xì)胞與未染色的CBMC和2.扣g/mlI巧(A和B)或廝帶血源性嗜酸性粒細(xì)胞(CBEo)和5 μg/mlI巧(C和D)混合，然后在37°C溫育2地。將細(xì)胞混合物用艦化丙晚(PI)染色，然后進(jìn)行 流式細(xì)胞術(shù)分析。Pr細(xì)胞在CFSEhi組分中的百分比代表總腫瘤細(xì)胞毒性，并且結(jié)果W柱狀 圖形式示出。(A)在不同的效應(yīng)細(xì)胞:祀細(xì)胞比率下CBMC和hi巧介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性。（B)添 加化g/ml的封閉抗體或同種型對照化:Τ比率4:1)。（0在不同的效應(yīng)細(xì)胞:祀細(xì)胞比率下 〔860和}11姐介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性。（0)添加化旨/1111封閉抗體或101]/1111肝素?；?1'比率2.5: 1)。運里還顯示了由單獨的抗體誘導(dǎo)的腫瘤死亡的數(shù)據(jù)（即，在不存在效應(yīng)細(xì)胞的情況下）。 顯示的結(jié)果為一個代表性實驗的平均值±SD。學(xué)生t檢驗*，ρ<0.05;**，ρ<0.01;***，ρ< 0.005。
[0016]圖3.腫瘤特異性I巧抑制體內(nèi)腫瘤生長。在第0天將105個4Τ1.hMUCl腫瘤細(xì)胞皮下 接種到hFceRI小鼠的兩偵U。在第1、2、3、4和5天施用20yg對照或3C6.hIgE(抗hMUCl)。獲取2 維卡尺測量值，直到腫瘤面積超過300mm2"(A)平均腫瘤大小對時間的曲線圖。誤差條表示 每個組的平均值±50。在最后的時間點每個組的存活小鼠/總小鼠數(shù)在括號中指出。抗 hMUCl組明顯不同于對照組(雙向4顯￥4，口<0.001)。（8和〇從(4)中所示的實驗在第34天從 存活的小鼠收獲腫瘤、切片并針對肥大細(xì)胞染色。肥大細(xì)胞在腫瘤的中屯、區(qū)W及在瘤周區(qū) 域中基本上不存在。存在的肥大細(xì)胞(紅色箭頭)未脫粒(B)。僅有來自3C6.hi巧處理組的小 鼠的一個腫瘤含有被肥大細(xì)胞浸潤的區(qū)域，其顯示了脫粒的證據(jù)(C)。
[0017]圖4.}^1](：1特異性的小鼠1邑6介導(dǎo)。。61?1中的完全腫瘤排斥。將用人11](：1、抗hMUClI巧(3C6.mIgE)和/或細(xì)胞因子(MCP-1、比-5)轉(zhuǎn)染的4T1腫瘤細(xì)胞的四種不同組合在 第0天皮下接種到hFceRITg+小鼠的兩側(cè)。每只小鼠總共施用1〇5個細(xì)胞(n= 4只/組）"(A)四 個實驗組的說明。（B)實驗被設(shè)計為測試I姐抗體與同族抗原(MUC1)和被所研究的兩種細(xì)胞 因子吸引的髓樣細(xì)胞的相互作用。將細(xì)胞混合，然后立即皮下注射到FceRIKO/Tg小鼠的兩 側(cè)（100，000個細(xì)胞/小鼠）。通過二維卡尺生長來監(jiān)控腫瘤生長。除了第4組外，在每個組中 均觀察到了漸進(jìn)生長，在第4組中，腫瘤可暫時性觸知，然后永久性消退。所示的數(shù)據(jù)代表兩 個單獨的實驗。誤差條表示平均腫瘤大小±SD。
[001引圖S.hMUCl特異性的小鼠I巧介導(dǎo)化εΚΙKO/Tg小鼠中的完全腫瘤排斥。各個生長 曲線W及得自圖6所示實驗的重復(fù)實驗的腫瘤測量平均值。將表達(dá)3C6.ml巧或細(xì)胞因子的 4T1腫瘤細(xì)胞如圖6A中所示進(jìn)行混合。數(shù)據(jù)得自各個腫瘤測量(A，C)或腫瘤體積的平均值 (B，D)。注意，在重復(fù)實驗中，存在一組共4個表現(xiàn)出生長的腫瘤，盡管生長動力學(xué)大大降低。
[0019]圖6.hMUCl特異性的小鼠I巧不能在野生型小鼠中介導(dǎo)完全的腫瘤排斥，但掲示出 預(yù)防轉(zhuǎn)移的能力。將表達(dá)3C6.hi姐或細(xì)胞因子的各組4T1腫瘤細(xì)胞如圖6A中所示進(jìn)行混合， 并注入Ba化/c小鼠中。顯示了各個腫瘤生長曲線(A，B)，和小組的平均值(C，D)。未在化εΚΙ KO/Tg小鼠中生長的第4組腫瘤在野生型小鼠中生長，盡管生長動力學(xué)大大降低。注意，第3 組腫瘤(單獨的4Tl/hMUCl和細(xì)胞因子)表現(xiàn)出中等生長動力學(xué)。Ξ只化eRIKO/Tg轉(zhuǎn)基因小 鼠包括在該實驗中作為陽性對照，并且所有Ξ只在用第4組腫瘤注射時均未能展示出任何 腫瘤生長(D圖，Π-Π)。第3組腫瘤(僅MUC1和細(xì)胞因子）降低的生長動力學(xué)可能源于W下 事實:運些小鼠在腫瘤發(fā)展過程的早期發(fā)生了轉(zhuǎn)移，并且到第10天時開始體重減輕（圖7)。 具有第4組腫瘤(3C6-mIgE+MUCl+細(xì)胞因子）的小鼠未顯示出體重減輕或其他明顯的轉(zhuǎn)移跡 象，盡管在其兩側(cè)具有小的腫瘤。
[0020] 圖7.第3和第4組小鼠中的體重減輕動力學(xué)。對用第3和第4組腫瘤注射的野生型小 鼠每5天進(jìn)行稱重，并計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。注意，到第1