一種多肽納米膠束及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，具體而言，涉及一種以聚乙二醇化磷脂為載體的 多肽納米膠束，及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 惡性癌癥是目前全球發(fā)病和死亡的主要原因，其中約90%的癌癥患者死于癌癥轉(zhuǎn) 移和復發(fā)，阻斷癌癥轉(zhuǎn)移的某個環(huán)節(jié)以達到遏制癌癥擴散的目的對于癌癥的治療至關重 要。趨化因子與趨化因子受體不僅參與正常生理活動，而且參與癌癥發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移等病 理過程，其中CXCR4/SDF-1 (或0乂0^12)在癌癥迀移和侵襲過程中起著重要作用，發(fā)展0乂0?4 受體的詰抗劑對于控制癌癥轉(zhuǎn)移、提尚癌癥治愈率非常關鍵。
[0003] 由于多肽易于設計合成、在人體內(nèi)易于代謝并且不會帶來毒副作用和嚴重的免疫 反應，因此開發(fā)CXCR4受體的多肽拮抗劑為癌癥治療提供了新的有效手段和策略。然而，多 肽藥物通常存在口服給藥生物活性低、易降解和體內(nèi)半衰期短、水溶性不理想等問題，導致 其臨床應用受到極大限制，亟需開發(fā)新的制劑和工藝來改善多肽藥物的體內(nèi)外穩(wěn)定性，提 高藥物在癌癥組織中的有效濃度和延長體內(nèi)循環(huán)時間，這對于治療轉(zhuǎn)移性癌癥具有重要的 實際意義。
[0004] 為了提高多肽藥物的穩(wěn)定性和生物利用度，迄今為止人們進行了許多載體方面的 研究。例如：利用生物相容性可降解材料(例如聚乳酸或乳酸-乙醇酸共聚物）包裹多肽分 子，制成微球制劑，通過高分子材料的降解來控制藥物釋放，維持有效的血藥濃度。但多數(shù) 微球制劑都存在藥物突釋及隨后的低釋現(xiàn)象，會造成血藥濃度過高或者過低，此外，微球制 劑在生產(chǎn)過程中也容易造成多肽的降解。利用脂質(zhì)體包載親水性或親脂性多肽雖然能夠提 高多肽的穩(wěn)定性，但是單位質(zhì)量脂質(zhì)體中可包載的多肽量通常較低，藥物的生物利用度難 以達到期望值。因此，需要開發(fā)新的載體系統(tǒng)來提高多肽的包載量及維持釋放期間的有效 血藥濃度。
[0005] 聚合物型膠束是一類受到廣泛關注的新型藥物載體，是由兩親性嵌段聚合物在合 適的濃度和溫度條件下在溶劑體系中自發(fā)地形成的直徑小于IOOnm的核-殼結(jié)構(gòu)體系。目 前，聚合物型膠束主要用于小分子化療藥物的包載，不僅可以有效解決化療藥物水溶性差、 體循環(huán)中降解較快、藥物吸收困難及毒副作用大等問題，還能通過滲透滯留增強效應(EPR) 實現(xiàn)其在癌癥病灶區(qū)域的富集。雖然，利用聚合物膠束包載多肽的研究在國內(nèi)外的報道中 還很少，但從兩者的物理化學性質(zhì)方面來看，膠束載體的疏水核及核殼層能夠?qū)λ苄暂^ 低的多肽或兩親性多肽具有較高的包載能力，膠束載體的親水冠能保護多肽不受蛋白酶的 降解，增加多肽的體內(nèi)外穩(wěn)定性;此外，從生物相容性角度考慮，多肽被膠束化后能夠提高 其在循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定時間，增加多肽的生物利用度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種多肽納米膠束及其制備方法和應用，所述 多肽納米膠束由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和癌癥靶向性多肽自組裝形成，該多肽納米膠束 提高了水溶性好但鹽溶性差的癌癥靶向性多肽在鹽溶液中溶解性和生物穩(wěn)定性，提高了多 肽和靶點的結(jié)合效率而發(fā)揮抗腫瘤作用，該多肽納米膠束具有抑制癌癥轉(zhuǎn)移的作用。
[0007] 本發(fā)明采用如下技術方案：
[0008] 一種多肽納米膠束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和癌癥靶向性多肽自組裝形成， 所述癌癥靶向性多肽是能夠與表達或過量表達趨化因子受體CXCR4的癌癥細胞或癌癥組織 靶向結(jié)合的多肽。
[0009] 上述多肽納米膠束，其中：
[0010] 所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)為聚乙二醇(親水嵌段)通過共價鍵和磷脂分子(疏 水嵌段)上的含氮堿基結(jié)合形成的化合物。
[0011]優(yōu)選地，所述聚乙二醇化磷脂（PEG-PE)分子中的聚乙二醇親水嵌段的分子量為 500~10000，進一步優(yōu)選為1500~5000，更優(yōu)選為2000~3000;最優(yōu)選為2000。
[0012] 優(yōu)選地，所述多肽納米膠束的粒徑為IO-IOOnm;進一步優(yōu)選為10-50nm;更優(yōu)選為 15_30nm〇
[0013]優(yōu)選地，所述癌癥靶向性多肽選自以極性氨基酸為主、以疏水氨基酸為主、或者兼 有極性氨基酸和疏水性氨基酸的多肽中的一種或幾種。
[0014]優(yōu)選地，所述癌癥靶向性多肽由5~100個氨基酸組成，進一步優(yōu)選為10~50個氨 基酸，更優(yōu)選為20~30個氨基酸。
[0015] 最優(yōu)選地，所述癌癥革巴向性多肽為E5多肽或FITC( fluoresce in i SOthiocyanate， 異硫氰酸熒光素)標記的E5多肽。
[0016] 所述E5多肽由22個氨基酸組成。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，該E5多肽能主動靶向到高表達CXCR4 受體的腫瘤細胞表面，進而發(fā)揮作用。
[0017] 具體地，所述E5多肽的氨基酸序列：GGRSFFLLRRIQGCRFRNTVDD;所述FITC標記的E5 多肽的氨基酸序列：FITC-GGRSFFLLRRIQGCRFRNTVDD。
[0018]所述E5多肽或FITC標記的E5多肽可按現(xiàn)有常規(guī)技術人工合成，也可外購商品化產(chǎn) 品，例如由上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣傻腅5多肽或FITC標記的E5多肽，純度為98%。 [0019]所述E5多肽或FITC標記的E5多肽具有水溶性好、鹽溶性差的特點。
[0020]所述E5多肽相關信息參見文獻www·nature · com/scientif icreports，4 :6610 I DOI:10.1038/srep06610 1,A designed peptide targeting CXCR4 displays antiacute myelocytic leukemia activity in vitro and in vivo(一種革巴向CXCR4的治療白 血病的多肽），Xiaojin Li et al.(李瀟瑾等）。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和所述癌癥靶向性多肽的摩爾比為4~20: 1，例如可以是20:1、10:1、5:1或4:1。
[0022]優(yōu)選地，所述癌癥靶向性多肽與PEG-PE的結(jié)合方式為物理結(jié)合。
[0023] 優(yōu)選地，所述多肽納米膠束為溶液形式或凍干形式。
[0024] 本發(fā)明還提供上述多肽納米膠束的制備方法，包括如下步驟：
[0025]分別制備PEG-PE分子溶液和多肽分子溶液;將PEG-PE分子溶液和多肽分子溶液混 勻、孵育、靜置，獲得多肽-PEG-PE納米膠束溶液。
[0026]上述多肽納米膠束的制備方法，其中：
[0027] 優(yōu)選地，制備I3EG-PE分子溶液和多肽分子溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液（即PBS溶 液）、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液、生理鹽水或無菌超純水中的任意一種;更優(yōu)選為磷酸鹽 緩沖液(即PBS溶液）；
[0028] 優(yōu)選地，將上述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子配制成2-20mg/mL溶液;將上述癌癥 革巴向性多肽分子配制成I -5mg/mL溶液；
[0029] 優(yōu)選地，所述混勻是將所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子溶液加入到所述癌癥靶 向性多肽分子溶液中，充分混勻，得混合溶液；
[0030]優(yōu)選地，所述混合溶液中聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子和癌癥靶向性多肽分子的 摩爾比為4~20:1，例如可以是20:1、10:1、5:1或4:1;
[0031 ] 優(yōu)選地，所述孵育溫度為20~60°C，孵育時間為10~60min;進一步優(yōu)選地，所述孵 育溫度為40~55°C，孵育時間為20~30min;
[0032] 優(yōu)選地，所述靜置為室溫(一般15_25°C)靜置2~24小時。
[0033] 根據(jù)需要，上述多肽納米膠束的制備方法還進一步包括將除菌后的多肽-PEG-PE 納米膠束溶液進行凍干，制備多肽納米膠束凍干粉的步驟。
[0034] 進一步優(yōu)選地，所述凍干包括向所得除菌后的多肽-PEG-PE納米膠束溶液中添加 一定量的凍干保護劑;所述凍干保護劑優(yōu)選為甘露醇，例如濃度為〇. 01~〇 . 2g/mL的甘露 醇。
[0035] 具體地，上述多肽納米膠束的制備方法，包括如下步驟：
[0036] (1)配制溶液：將上述聚乙二醇化磷脂（PEG-PE)分子用磷酸鹽緩沖液配制成2- 20mg/mL溶液;將上述癌癥祀向性多肽分子用磷酸鹽緩沖液配制成l_5mg/mL溶液；
[0037] (2)混勻：將所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子溶液加入到所述癌癥靶向性多肽 分子溶液中，充分混勻，得混合溶液；
[0038] (3)孵育:將步驟(2)中所得混合溶液于20~60°C水浴孵育10~60min;
[0039] 優(yōu)選地，所述孵育溫度為40~55°C，孵育時間為20~30min。
[0040] (4)靜置;優(yōu)選地，所述靜置為室溫(一般15-25°C)靜置2~24小時;得多肽-PEG-PE 納米膠束溶液。
[0041] 優(yōu)選地，上述多肽納米膠束的制備方法還進一步包括將靜置后所得多肽-PEG-PE 納米膠束溶液除菌的步驟，進一步優(yōu)選地，所述除菌為將步驟(4)靜置后所得多肽-PEG-PE 納米膠束溶液用〇. 22μπι濾膜過濾。
[0042]根據(jù)需要，上述多肽納米膠束的制備方法還進一步包括將除菌后的多肽-PEG-PE 納米膠束溶液進行凍干，制備多肽納米膠束凍干粉的步驟。
[0043]進一步優(yōu)選地，所述凍干包括向所得除菌后的多肽-PEG-PE納米膠束溶液中添加 一定量的凍干保護劑;所述凍干保護劑優(yōu)選為甘露醇，例如濃度為〇. 0