-10mg/kg體重/天） 聯(lián)合或組合使用。這些物質(zhì)包括但不限于:抗病毒藥物(如干擾素-α、拉米夫定、阿德福韋和 利巴韋林）、抗炎藥物(如糖皮質(zhì)激素，重組人白介素10)、抗氧化藥物(如水飛薊素和維生素 E)、抑制肝星狀細(xì)胞分化激活藥物(如依馬替尼及其類似物、索拉菲尼等）、血管緊張素轉(zhuǎn)換 酶抑制劑等。
[0137] 本發(fā)明的組合物還可與除藥物治療外的其它常用于治療或預(yù)防肝纖維化的方法 或手段相結(jié)合。這些方法或手段包括但不限于:手術(shù)治療、針灸、合理膳食等。
[0138] 當(dāng)這些物質(zhì)或方法與基于O-GlcNAc糖基化修飾的活性物質(zhì)組合或聯(lián)合施用時(shí)，優(yōu) 選具有優(yōu)于分別單獨(dú)給予這些物質(zhì)或方法的效果。
[0139] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0140] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括但不限于：
[0141] (a)首次發(fā)現(xiàn)通過增強(qiáng)O-GIcNAc糖基化修飾能夠抑制肝星狀細(xì)胞過度活化和增 殖，抑制肝臟中平滑肌肌動(dòng)蛋白和I型膠原的表達(dá)以及纖維間隔的形成，從而在預(yù)防和/ 或治療肝纖維化的形成和發(fā)展中具有良好的應(yīng)用前景；
[0142] (b)目前已知的基于O-GIcNAc糖基化修飾的活性物質(zhì)，包括氨基葡萄糖、N-乙酰氨 基葡萄糖等，已證明對人體無毒副作用，因此在治療和/或預(yù)防肝纖維化中具有高安全性；
[0143] (c)目前已知的基于O-GIcNAc糖基化修飾的活性物質(zhì)，包括氨基葡萄糖等，已經(jīng)用 于治療骨關(guān)節(jié)疾病，包括關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生和半月板損傷等。由于肝纖維化常見于中老年 人，往往伴發(fā)關(guān)節(jié)炎等疾病，因此在使用基于O-GIcNAc糖基化修飾的活性物質(zhì)治療和/或預(yù) 防肝纖維化的同時(shí)可以治療此類骨關(guān)節(jié)疾病。
[0144]本文中提供的所有數(shù)值范圍旨在清楚地包括落在范圍端點(diǎn)之間的所有數(shù)值及它 們之間的數(shù)值范圍?？蓪Ρ景l(fā)明提到的特征或?qū)嵤├岬降奶卣鬟M(jìn)行組合。本說明書所揭 示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似 特征的一般性例子。
[0145] 實(shí)施例
[0146] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明做出適當(dāng)?shù)男薷?、變?dòng)，這些修改 和變動(dòng)都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0147] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，可采用本領(lǐng)域中的常規(guī)方法，例如參 考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第三版，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或按照供應(yīng)商所建議的條件。DNA的測序方法為本領(lǐng)域常 規(guī)的方法，也可由商業(yè)公司提供測試。
[0148] 除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有 專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均 等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之 用。
[0149] 實(shí)施例1.N-乙酰氨基葡萄糖預(yù)處理抑制TAA誘導(dǎo)的小鼠肝臟纖維化
[0150]為了檢測N-乙酰氨基葡萄糖是否對硫代乙酰胺(TAA)造成的肝纖維化具有保護(hù)作 用，發(fā)明人構(gòu)建TAA小鼠肝纖維化模型，在進(jìn)行TAA造模時(shí)，同時(shí)采用不同劑量N-乙酰氨基葡 萄糖進(jìn)行腹腔注射，并觀察N-乙酰氨基葡萄糖對TAA造成的肝纖維化病理形態(tài)學(xué)及肝功能 的保護(hù)作用。
[0151] 造模及用藥劑量:
[0152]
[0153] 其中，所用TAA、N_乙酰氨基葡萄糖和水飛薊素均購自Sigma公司，批號分別為： 163678-25G;A8625-25G;S0292。
[0154] 動(dòng)物分組及給藥:
[0155] 健康Balb/C小鼠，雄性，4-6周齡，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將小鼠隨機(jī)分為 4組:正常組（圖中標(biāo)注為"N"，10只）、模型組（圖中標(biāo)注為"T"，10只）、N-乙酰氨基葡萄糖低 劑量組（圖中標(biāo)注為"L"，10只）、N-乙酰氨基葡萄糖高劑量組（圖中標(biāo)注為"H"，10只）、水飛 薊素組(圖中標(biāo)注為"S"，10只）。
[0156] 模型組、N-乙酰氨基葡萄糖低劑量組、N-乙酰氨基葡萄糖高劑量組、水飛薊素組分 別給予TAA腹腔注射，并自首次給予TAA當(dāng)日開始給藥，連續(xù)8周給予各劑量N-乙酰氨基葡萄 糖腹腔注射或水飛薊素灌胃，模型組給予雙蒸水腹腔注射;正常組小鼠給予雙蒸水腹腔注 射。8周后，處死全部小鼠。
[0157] 樣品的米集處理:
[0158]小鼠采用摘眼球取血，所采血液收集于Eppendorf管，室溫靜置4小時(shí)，3000rpm離 心IOmin，分離血清，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0159] 小鼠脫頸椎處死后，打開腹腔，摘取肝臟，于肝右葉切取0.5cmX0.5cm大小肝組織 2塊于4°C多聚甲醛固定，用于病理標(biāo)本制備;其余肝組織以Eppendorf管分裝后液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0160] I.肝纖維化病理形態(tài)學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果與分析:
[0161] 切片和烤片:石蠟包埋組織5μπι連續(xù)切片，貼于APES處理過的載玻片上，60°C (于電 熱恒溫干燥箱內(nèi)，下同）烤片6-8h。
[0162] HE染色:脫錯(cuò)至水:烤片lh，二甲苯IlOmin-二甲苯IllOmin-無水酒精I(xiàn)3min-無 水酒精I(xiàn)I2min-95%酒精2min-85%酒精2min-70%酒精2min-自來水反復(fù)清洗-蘇木 精染液15min-自來水反復(fù)清洗-鹽酸酒精分化3秒-自來水反復(fù)清洗至細(xì)胞核變藍(lán)為止 (鏡檢)-伊紅2~3秒-95 %酒精I(xiàn) lmin-95%酒精11 lmin-無水酒精I(xiàn) lmin-無水酒精I(xiàn)I lmin-滴一滴中性樹脂，蓋片鏡檢。
[0163] 天狼星紅染色：脫蠟至水:烤片Ih，然后依次放入以下配好的溶液當(dāng)中：二甲苯I lOmin-二甲苯11 lOmin-無水酒精I(xiàn)3min-無水酒精I(xiàn) I2min-95 %酒精2min-85 %酒精 2min-70 %酒精2min-自來水反復(fù)清洗-甩干，擦邊-滴加天狼星紅染液一滴，置濕盒37 °C，20min-無水酒精分化-二甲苯12min-二甲苯II 2min-滴一滴中性樹脂，蓋片鏡檢。
[0164] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：
[0165] 如圖IA所示:HE染色顯示，模型組(T)小鼠肝內(nèi)正常肝小葉結(jié)構(gòu)喪失，肝細(xì)胞呈水 樣變性或脂肪變性，增生的纖維組織將原來的肝小葉分割，包繞正常肝小葉，形成大小不等 的假小葉，纖維間隔內(nèi)有大量成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤，排列較為紊亂。與模型組相比， N-乙酰氨基葡萄糖組(L、H)纖維結(jié)締組織疏松、纖細(xì)、不連續(xù)，纖維束內(nèi)的成纖維細(xì)胞減少， 纖維化程度有所改善并呈劑量依賴性。
[0166]天狼星紅染色顯示，模型組(T)肝組織膠原纖維彌漫性增生并由匯管區(qū)向肝小葉 組織內(nèi)伸展，分割包繞肝組織，形成明顯的纖維間隔，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失形成假小葉。N-乙酰氨基葡萄糖組(L、H)肝內(nèi)纖維間隔變窄不連續(xù)，無完整假小葉結(jié)構(gòu)，且呈劑量依賴性改 善。水飛薊素組(S)炎細(xì)胞浸潤情況、假小葉形成及纖維化程度與模型組(T)相比也有一定 程度的改善。
[0167]在肝纖維化中，活化的肝星狀細(xì)胞分泌大量包括I型膠原在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)，對肝 臟實(shí)質(zhì)進(jìn)行包繞分割，形成假小葉。天狼星紅染色后紅色的I型膠原面積統(tǒng)計(jì)顯示，N-乙酰 氨基葡萄糖預(yù)處理對TAA誘導(dǎo)的小鼠肝臟中I型膠原沉積和肝纖維化有極顯著改善作用，且 具有一定劑量依賴性。
[0168] II.肝臟中纖維化指標(biāo)的mRNA水平變化的檢測方法、結(jié)果與分析
[0169] 發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)，檢測肝臟中纖維化指標(biāo)的mRNA水平的變化。
[0170] 組織RNA抽提：
[0171 ] 使用Trizol試劑（Invitrogen公司），按照Invitrogen公司RNA抽提方法進(jìn)行操作。
[0172] RNA 逆轉(zhuǎn)錄：
[0173] 使用RNA PCR試劑盒（AMV)Ver · 3 · 0(Takara Biotechnology，中國大連），按照 Takara公司該試劑盒說明書進(jìn)行操作。
[0174] 實(shí)時(shí)PCR檢測：
[0175] 使用ABI Stepone Plus實(shí)時(shí)焚光定量PCR擴(kuò)增儀，按TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說明書進(jìn)行操作。
[0176]引物序列：
[0177] 小鼠 GAPDH
[0178] 正向引物:GAGCGAGACCCCACTAACAT(SEQ ID NO. :1)
[0179] 反向引物：TCTCCATGGTGGTGAAGACA(SEQ ID NO. :2)
[0180] 小鼠膠原Ial(Collagen Ial)
[0181] 正向引物:AGAGCATGACCGATGGATTC(SEQ ID NO. :3)
[0182] 反向引物：CCTTCTTGAGGTTGCCAGTC(SEQ ID NO. :4)
[0183] /Mia-SMA
[0184] 正向引物:ATGAAGCCCAGAGCAAGAG(SEQ ID NO. :5)
[0185] 反向引物：TTTCCATGTCGTCCCAGT(SEQ ID NO. :6)
[0186] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：
[0187] 實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果如圖IB所示，該結(jié)果表明，在纖維化肝臟中，N-乙酰氨基葡萄糖可 以極顯著降低a-SMA和I型膠原的mRNA水平，且該降低水平具有一定N-乙酰氨基葡萄糖劑量 依賴性。
[0188] III.小鼠血清ALT和AST水平的檢測方法、結(jié)果與分析
[0189] 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)是反映肝功能的重要指標(biāo)，本實(shí)施例中進(jìn)一 步驗(yàn)證了 N-乙酰氨基葡萄糖預(yù)處理對小鼠血清ALT和AST的影響。
[0190] 血清ALT和AST檢測：
[0191] ALT及AST檢測方法依照南京建成檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。以下試劑盒均購自 南京建成生物工程研究所：
[0192] 谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/G0T)測定試劑盒(賴氏法）
[0193] 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測定試劑盒(賴氏法）
[0194] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：
[0195]如圖IC所示，N-乙酰氨基葡萄糖預(yù)處理可以極顯著抑制TAA介導(dǎo)的谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST/G0T)水平的上調(diào)，同時(shí)極顯著抑制TAA介導(dǎo)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)的上調(diào)，提示N-乙 酰氨基葡萄糖對于肝纖維化中肝功能障礙具有保護(hù)作用。
[0196] 實(shí)施例2.氨基葡萄糖預(yù)處理抑制TAA誘導(dǎo)的小鼠肝臟纖維化
[0197] 為了檢測氨基葡萄糖是否對硫代乙酰胺(TAA)造成的肝纖維化具有保護(hù)作用，發(fā) 明人構(gòu)建TAA小鼠肝纖維化模型，在進(jìn)行TAA造模同時(shí)，采用不同劑量氨基葡萄糖進(jìn)行腹腔 注射，并觀察氨基葡萄糖對TAA造成的肝纖維化病理形態(tài)學(xué)及肝功能的保護(hù)作用。
[0198] 造模及用藥劑量:
[0200]其中，所用TAA、氨基葡萄糖和水飛薊素均購自Sigma公司，批號分別為：163678-25G;G4875-25G;S0292。
[0201 ] 動(dòng)物分組及給藥:
[0202] 健康Balb/C小鼠，雄性，4-6周齡，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將小鼠隨機(jī)分為 4組:正常組（圖中標(biāo)注為"N"，10只）、模型組（圖中標(biāo)注為"T"，10只）、氨基葡萄糖低劑量組 (圖中標(biāo)注為"L"，10只）、氨基葡萄糖高劑量組（圖中標(biāo)注為"Η"，10只）、水飛薊素組（圖中標(biāo) 注為"S"，10只）。
[0203] 模型組、氨基葡萄糖低劑量組、氨基葡萄糖高劑量組、水飛薊素組分別給予TAA腹 腔注射，自首次給予TAA當(dāng)日開始給藥，連續(xù)8周給予各劑量氨基葡萄糖腹腔注射或水飛薊 素灌胃（同前），模型組給予雙蒸水腹腔注射;正常組小鼠給予雙蒸水腹腔注射。8周后，處死 全部小鼠。
[0204] 樣品的米集處理:
[0205]小鼠采用摘眼球取血，所采血液收集于Eppendorf管，室溫靜置4小時(shí)，3000rpm離 心IOmin，分離血清，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0206] 小鼠脫頸椎處死后，打開腹腔，摘取肝臟，于肝右葉切取0.5cm X 0.5cm大小肝組織 2塊于4°C多聚甲醛固定，用于病理標(biāo)本制備;其余肝組織以Eppendorf管分裝后液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0207] I.肝纖維化病理形態(tài)學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果與分析:
[0208] 切片和烤片:石蠟包埋組織5μπι連續(xù)切片，貼于APES處理過的載玻片上，60°C (于電 熱恒溫干燥箱內(nèi)，下同）烤片6-8h。
[0209] HE染色:脫錯(cuò)至水:烤片lh，二甲苯IlOmin-二甲苯IllOmin-無水酒精I(xiàn)3min-無 水酒精I(xiàn)I2min-95%酒精2min-85%酒精2min-70%酒精2min-自來水反復(fù)清洗4蘇本 精染液15min-自來水反復(fù)清洗-鹽酸酒精分化3秒-自來水反復(fù)清洗至細(xì)胞核變藍(lán)為止 (鏡檢)-伊紅2~3秒-95%酒精I(xiàn)lmin-95%酒精I(xiàn)II min-無水酒精I(xiàn)lmin-無水酒精I(xiàn)I lmin-滴一滴中性樹脂，蓋片鏡檢。
[0210] 天狼星紅染色：脫蠟至水:烤片Ih，然后依次放入以下配好的溶液當(dāng)中：二甲苯I lOmin-二甲苯11 lOmin-無水酒精I(xiàn)3min-無水酒精I(xiàn) I2min-95 %酒精2min-85 %酒精 2min-70 %酒精2min-自來水反復(fù)清洗-甩干，擦邊-滴加天狼星紅染液一滴，置濕盒37 °C，20min-無水酒精分化-二甲苯12min-二甲苯II 2min-滴一滴中性樹脂，蓋片鏡檢。
[0211] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：
[0212]如圖2A所示:HE染色顯示，模型組⑴小鼠肝內(nèi)正常肝小葉結(jié)構(gòu)喪失，肝細(xì)胞呈水 樣變性，增生的纖維組織包繞正常肝小葉，中央靜脈匯管區(qū)有大量成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞 浸潤，排列較為紊亂。與模型組(T)相比，氨基葡萄糖組(L、H)纖維結(jié)締組織疏松、纖細(xì)，纖維 束內(nèi)的成纖維細(xì)胞減少，纖維化程度有所改善并呈劑量依賴性。
[0213] 天狼星紅染色顯示，模型組(T)肝組織膠原纖維彌漫性增生并由匯管區(qū)向肝小葉 組織內(nèi)伸展，分割包繞肝組織，形成明顯的纖維間隔，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失形成假小葉。氨 基葡萄糖組(L、H)肝內(nèi)纖維間隔變窄不連續(xù)，無完整假小葉結(jié)構(gòu)，且呈劑量依賴性改善。水 飛薊素組（S)炎細(xì)胞浸潤情況、假小葉形成及纖維化程度與模型組相比也有一定程度的改 善。
[0214] 天狼星紅染色面積統(tǒng)計(jì)顯示，氨基葡萄糖預(yù)處理對TAA誘導(dǎo)的小鼠肝臟中I型膠原 沉積和肝纖維化有極顯著改善作用，且呈一定劑量依賴性。
[0215] II.肝臟(同前）中纖維化指標(biāo)的mRNA水平變化的檢測方法、結(jié)果與分析
[0216] 發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)，檢測肝臟中纖維化指標(biāo)的mRNA水平的變化。
[0217] 組織RM抽提：
[0218] 使用Trizol試劑（Invitrogen公司），按照Invitrogen公司RNA抽提方法進(jìn)行操作。
[0219] RNA 逆轉(zhuǎn)錄：
[0220] 使用RNA PCR試劑盒