用于抗癌化療法的籠狀鉑金納米團(tuán)簇的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于抗癌化療法的籠狀鉑金納米團(tuán)簇 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明關(guān)于抗癌癥的化學(xué)療法。
[0002] 【先前技術(shù)】
[0003] 鉑(Pt)被視為一種貴重金屬，它不像順鉑僅藉由水就可活化其毒性，Pt僅可溶解 于強(qiáng)腐蝕劑中，例如王水(HN03/HC1)。王水首先氧化的后溶解Pt以形成含Pt氯復(fù)合物。最近 已發(fā)現(xiàn)縮小Pt的體積以增加表面積比，進(jìn)而允許氧氣吸附并促進(jìn)表面腐蝕的水氧化反應(yīng)， 可顯著地增加氧化的程度。然而，如何有效地縮小Pt，仍是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004] 在一方面，本發(fā)明關(guān)于一種雙重籠狀鉬納米團(tuán)簇復(fù)合物(double-caged platinum nanocluster complex)，其包含(a)樹(shù)枝狀聚合物(dendrimer); (b)包含鉬氧化物的鉬納米 團(tuán)簇，該鉑納米團(tuán)簇被限制在該樹(shù)枝狀聚合物之內(nèi)；及(c)聚乙二醇(PEG)，其涂布于該樹(shù)枝 狀聚合物的表面。該樹(shù)枝狀聚合物可以是胺基終端樹(shù)枝狀聚合物。
[0005] 在另一方面，本發(fā)明關(guān)于一種籠狀鉑納米團(tuán)簇復(fù)合物，其包含(a) -胺基終端樹(shù)枝 狀聚合物;及(b)-包含鉑氧化物及具有平均直徑為0.93nm，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22nm的鉑納米團(tuán) 簇，該鉑納米團(tuán)簇被限制在該胺基終端樹(shù)枝狀聚合物之內(nèi)。
[0006] 在另一方面，本發(fā)明關(guān)于一種合成上述籠狀鉑納米團(tuán)簇復(fù)合物的方法，其包括下 列步驟：
[0007] (a)混合包含八面體六氯鉑酸鹽陰離子的第一溶劑與包含一胺基終端樹(shù)枝狀聚合 物或一羥基終端樹(shù)枝狀聚合物的第二溶劑，以形成包含PtCl，陰離子/樹(shù)枝狀聚合物復(fù)合 物的混合物；
[0008] (b)培養(yǎng)該包含PtClf陰離子/樹(shù)枝狀聚合物復(fù)合物的混合物達(dá)一段足夠的時(shí)間；
[0009] (C)還原PtClf陰離子/樹(shù)枝狀聚合物中的PtClf陰離子，以形成包含樹(shù)枝狀聚合 物籠狀鉬(dendrimer caged platinum)的納米團(tuán)簇復(fù)合物的混合物；
[0010] (d)將包含該樹(shù)枝狀聚合物籠狀鉑的納米團(tuán)簇復(fù)合物的混合物通過(guò)過(guò)濾器，以得 到包含該樹(shù)枝狀聚合物籠狀鉑的納米團(tuán)簇復(fù)合物的濾液;及
[0011] (e)冷凍干燥該過(guò)濾液以得到樹(shù)枝狀聚合物籠狀鉑的納米團(tuán)簇復(fù)合物。在另一方 面，本發(fā)明關(guān)于一種合成雙重籠狀鉑納米團(tuán)簇復(fù)合物的方法，其包括：
[0012] (i)溶解上述樹(shù)枝狀聚合物籠狀鉑的納米團(tuán)簇復(fù)合物于溶劑中以形成溶液，該復(fù) 合物包含：
[0013] (a)胺基終端的樹(shù)枝狀聚合物或羥基終端的樹(shù)枝狀聚合物;及
[0014] (b)包含鉑氧化物的鉑納米團(tuán)簇，其被限制在該胺基終端的樹(shù)枝狀聚合物或該羥 基終端的樹(shù)枝狀聚合物之內(nèi)；
[0015] (ii)當(dāng)該樹(shù)枝狀聚合物為胺基終端時(shí)，加入PEG-醛至該溶液中；或當(dāng)該樹(shù)枝狀聚 合物為羥基終端時(shí)，加入PEG-NH2至該溶液中；及
[0016] (iii)允許PEG-醛與該胺基終端的樹(shù)枝狀聚合物的一級(jí)胺進(jìn)行反應(yīng);或允許PEG- NH2與羥基終端的樹(shù)枝狀聚合物進(jìn)行反應(yīng)，藉此獲得雙重籠狀鉑納米團(tuán)簇復(fù)合物。
[0017] 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明關(guān)于一種上述籠狀鉑納米團(tuán)簇復(fù)合物或雙重籠狀鉑納米 團(tuán)簇復(fù)合物制備于所需個(gè)體抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物的用途?；蛘?，本發(fā)明關(guān)于一種上述 籠狀鉑納米團(tuán)簇復(fù)合物或雙重籠狀鉑納米團(tuán)簇復(fù)合物于個(gè)體所需抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的用 途。
[0018] 另一方面，本發(fā)明關(guān)于一種醫(yī)藥組合物，其包含：
[0019] (a)治療有效量的前述復(fù)合物;及
[0020] (b)醫(yī)藥上可接受的載劑。
[0021] 藉由以下較佳實(shí)施例的敘述并配合以下附圖的說(shuō)明，將更清楚了解本發(fā)明的各方 面內(nèi)容。附隨附圖例示本發(fā)明的一或多種態(tài)樣，并配合文字?jǐn)⑹鲆越忉尡景l(fā)明的原理。無(wú)論 在什么可能的情況下，相同的參照編號(hào)在各附圖中用于指涉一實(shí)施態(tài)樣的相同或相似組 件。 【【附圖說(shuō)明】】
[0022] 圖IA顯示一種基于調(diào)控陰離子幾何特性以形成PN的新穎策略；途徑（i)及（ii)顯 *G2NH2的外部及內(nèi)部分別選擇性地與平面PtCl，及八面體PtClf交聯(lián)。
[0023] 圖IB顯示籠狀PN與腫瘤侵入性肽混合，以標(biāo)靶腫瘤并藉由脫去外部PEG冠，進(jìn)而在 腫瘤內(nèi)部活化以殺死惡性細(xì)胞?？拱┕πУ年P(guān)鍵在于，PN失去其內(nèi)因性化學(xué)鈍性，而在弱酸 性胞器中表現(xiàn)其溶解性。
[0024] 圖2A-B顯示PtCl42VG2NH2復(fù)合物(A)及PtCl 62+/G2NH2復(fù)合物(B)的拉曼光譜，顯示 自前者復(fù)合物形成N-Pt-N協(xié)調(diào)性。
[0025]圖 2C-D顯示在還原前 PtCl42-/G2NH2 復(fù)合物（C)及PtCl62VG2NH2復(fù)合物（D)的HRTEM 影像。
[0026]圖2E-F顯示當(dāng)（C)及(D)復(fù)合物還原時(shí)，PN被籠在G2NH2外部(E)及內(nèi)部(F)。所有TEM 樣本在測(cè)量前兩天新鮮配置，并將一配置好的樣品予以自然干燥。所有的測(cè)量均在不存在 陰性染色的條件下進(jìn)行。
[0027]圖3A顯示CPN的IC5q值高于順鉑及卡鉑的IC5q值。其中插入圖顯示較低濃度，范圍 自 0至50yg/mL。
[0028] 圖3B是觀察細(xì)胞死亡途徑的顯微影像。將未經(jīng)處理或以大概50yg/mL CPN予以不 同時(shí)間處理的MDA-MB-231細(xì)胞以annexin V-FITC及PI予以雙重染色。上圖自左至右分別表 示未經(jīng)處理的細(xì)胞及經(jīng)CPN處理5小時(shí)的細(xì)胞。下圖則分別表示經(jīng)CPN處理10小時(shí)及24小時(shí) 的細(xì)胞。比例尺:30μπι。
[0029] 圖4Α-Β是XPS光譜顯示Pt(A)與氧(B)的鍵結(jié)能量，其中圖A特別代表CPN及Pt納米 粒子的（4f7/2)及(4f 5/2)部位。星星表示CPN的鍵結(jié)能量推移至73.4eV。以沉積于受質(zhì)上的金 膜的Au4f 7/2 (83.7eV)波峰作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品予以校正。
[0030] 圖4C顯示在細(xì)胞吸收過(guò)程中檢測(cè)CPN內(nèi)化途徑的各種胞引作用抑制劑。
[0031 ] 圖4D顯示MDA-MB-231細(xì)胞的CPN細(xì)胞吸收行為的共焦顯微影像；以FITC標(biāo)記CPN以 利觀察(綠色)及溶酶體追蹤(紅色），而CPN及溶酶體追蹤共處的區(qū)域呈黃色。細(xì)胞型態(tài)的改 變基于CPN的毒性。
[0032]圖4E顯示在擬內(nèi)體環(huán)境下，以ICP-MS測(cè)定本發(fā)明CPN溶解成Pt離子形式。CPN溶解 于王水(3:1HC1/HN03)作為對(duì)照組。
[0033]圖5A-F分別顯示經(jīng)IT及IV注射后，CPN(A-C)及DCPN(D-F)的抗癌治療效果。A)及E) 顯示腫瘤體積，B)表示每一群組在終點(diǎn)時(shí)腫瘤大小的代表影像，C)表示利用TUNEL測(cè)試所觀 察的凋亡性細(xì)胞死亡（比例尺:20ym)，D)腫瘤標(biāo)靶，及F)體重的記錄。以IT及IV注射帶有腫 瘤的裸鼠后，其體積分別達(dá)大概60mm 3及150mm3。動(dòng)物模式以兩組處理方式加以處理，包括IT 注射(PBS、G2NH2、CPN及順鉑）以及IV注射(？83、62順 2、丨1?^、00?~及順鉑）。為避免圖表過(guò)于 復(fù)雜，II^G2NH2及IV的iRGD的數(shù)據(jù)予以省略。在指定的日子測(cè)量腫瘤體積及小鼠體重。每一 數(shù)據(jù)表示給藥注射后腫瘤體積平均值的相對(duì)變化(n = 5，P<0.05且n. s表示未具統(tǒng)計(jì)上顯 著性KSD表誤差柱。注射次數(shù)以黑色箭頭標(biāo)記。
[0034] 圖6顯示CPN的EDS光譜，星星代表Pt訊號(hào)。
[0035]圖7A-C顯示CPN及PN聚集特征的比較，這些材料由調(diào)控陰離子幾何特性而制得。A) 代表溶解度，B)代表細(xì)胞毒性評(píng)估，C)代表胞內(nèi)吸收效率。
[0036]圖8A-D是顯微影像以比較順鉑誘發(fā)的細(xì)胞死亡與CPN誘發(fā)的細(xì)胞死亡的途徑。將 未經(jīng)處理或以30yg/mL順鉑予以不同時(shí)間處理的MDA-MB-231細(xì)胞以annexin V-FITC及PI予 以雙重染色。上圖自左至右分別表示未經(jīng)處理的細(xì)胞(A)及經(jīng)順鉑處理5小時(shí)的細(xì)胞(B)。下 圖則分別表示經(jīng)順鉑處理10小時(shí)(C)及24小時(shí)的細(xì)胞(D)。比例尺:50μπι。
[0037] 圖9顯示CPN生成R0S。將MDA-MB-231細(xì)胞在37°C、5%C〇2大氣壓下培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中（其中添加10%胎牛血清）。將細(xì)胞以IX IO5細(xì)胞/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培 養(yǎng)盤(pán)中，在37°C下培養(yǎng)24小時(shí)。之后以不同處理替換培養(yǎng)基，包括RG2HN2、CPN、順鉑及 0.03 %H2〇2。每次測(cè)試進(jìn)行3小時(shí)不更換培養(yǎng)基，移除細(xì)胞培養(yǎng)基的上清液后，分離細(xì)胞并利 用 CM-H2DCFDA( INVITR0GEN?)進(jìn)行 ROS 測(cè)試。
[0038]圖IOA顯示M的預(yù)估安全劑量及處理時(shí)間。值得注意的是，已知BA易于透過(guò)破壞粒 線體功能而導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞死亡。因此，BA的濃度與處理時(shí)間必須最小化且縮短，以避 免從抑制劑與CPN的增效效果而來(lái)的細(xì)胞死亡，導(dǎo)致在CPN處理期間BA的存在或不存在并未 產(chǎn)生顯著的差異。
[0039]圖IOB顯示內(nèi)體/溶酶體pH-上升導(dǎo)致CPN對(duì)細(xì)胞毒性的影響。
[0040]圖11顯示活性蛋白酶-3免疫染色所觀察到CPN所致凋亡性細(xì)胞死亡。比例尺:20μ m〇
[0041 ] 圖12A-C顯示DCPN及其前驅(qū)物的1H NMR光譜。
[0042] 圖13顯示在終點(diǎn)后CPN的生物清除(bio-clearance)。
[0043]圖14顯示G2NH2涂布可裂解PEG對(duì)于腫瘤標(biāo)靶與抗癌化療功效的比較。并未發(fā)現(xiàn)對(duì) 于腫瘤抑制具顯著功效。腫瘤質(zhì)量在終點(diǎn)時(shí)則顯著大于其初始點(diǎn)。
[0044]圖15顯示小鼠的食物攝取量。每一數(shù)據(jù)代表在藥物注射后每一籠內(nèi)（n = 5)所有食 物攝取量。
[0045]圖16A-D顯示在切開(kāi)的腫瘤內(nèi)組織H&E染色的比較。圖像A) -D)表不同的處理，包括 PBS、G2NH2、DCPN及順鉑（放大400倍）。 【【具體實(shí)施方式】】
[0046] 以下以較特定實(shí)施例描述本發(fā)明僅作為說(shuō)明之用，因?yàn)楦鞣N修飾及變化乃該技術(shù) 領(lǐng)域的技術(shù)人士所熟知者。此處詳細(xì)說(shuō)明