治療細胞內感染的方法
【專利說明】
[00011 本申請要求享有分別于2013年06月25日、2014年03月24日和2014年05月26日提交 的澳大利亞專利申請第2013902327、2014901029和2014901977號的優(yōu)先權。各個申請的公 開內容以引用的方式包含于本文中。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及一種治療細胞內感染的方法。所述方法包括給藥細胞凋亡抑制劑 (IAP)詰抗劑。
【背景技術】
[0003] 由病原體，如乙型肝炎病毒(HBV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類乳頭狀瘤病毒 (Human papilloma virus，HPV)、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、組織胞衆(zhòng) 菌屬(Histoplasma spp.)和皰原蟲屬(Plasmodium spp.)造成的慢性暴發(fā)性感染與病原體 特異性免疫的缺乏和會導致相關宿主細胞損壞的有害的異常非特異性炎癥反應有關。雖然 多年來已研發(fā)出各種治療策略，卻收效甚微。
[0004] 乙型肝炎是全世界分布的常見疾病，估計有280，000,000名HBV攜帶者。全球來看， 在東南亞、非洲和部分南美洲的發(fā)展中國家中，HBV感染是最為常見的，在那里，對低齡嬰幼 兒的垂直傳播導致很大比例的感染者轉變?yōu)镠BV慢性攜帶者。嬰幼兒時獲得HBV的男性死于 慢性HBV感染導致的肝硬化或原發(fā)性肝癌的幾率大約為40%。相比之下，出生時感染的女性 死于慢性乙肝感染導致的類似疾病的幾率大約為15%。
[0005] 盡管若干藥物現(xiàn)已處于臨床應用狀態(tài)，包括干擾素 a2b(IFNa2b)、干擾素 a2a、拉米 夫定（Iamivudine)、阿德福韋(adefovir)和恩替卡韋（entecavir)，但慢性乙肝感染仍舊難 以治療。治療在最開始時不起作用或會在出現(xiàn)耐藥病毒時變得不起作用。而且已知現(xiàn)有的 藥物療法面臨療程長、花銷大以及與不需要的副作用相關。例如，盡管在治療HBV感染方面 使用拉米夫定取得了某些成功，但其也與耐藥性風險的增長有關，所述耐藥性會在第二年 的治療之后高達45-55 %。此外，憑借這些療法不能將HBV從肝臟中完全清除，因此甚至在中 斷治療后，在許多病例中發(fā)生了HBV感染的復發(fā)。當慢性HBV感染的患者發(fā)生晚期肝衰竭時， 肝移植就成為唯一可選的治療形式。然而，由于HBV感染持續(xù)存在，移植物可能會受到感染， 因而限制了患者和移植物的存活率。
[0006] 人類免疫缺陷病毒/獲得性免疫缺陷綜合征(HIV/AIDS)也象征著全球性的健康危 機，特別是在發(fā)展中國家?？鼓孓D錄病毒藥物的使用顯著改變了 HIV感染者的生命預期和質 量。然而，盡管介入了此抗逆轉錄病毒藥物，持續(xù)激活免疫，也僅部分恢復了 CD4T細胞和B細 胞衰退和失去的免疫功能?；颊哌€會處于非AIDS定義的疾病和死亡因素，例如，癌癥、心血 管疾病、肝和腎衰竭、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂(例如，弓形蟲腦炎)和持續(xù)感染的風險下。
[0007] 本發(fā)明涉及治療細胞內感染的新方法的開發(fā)。

【發(fā)明內容】

[0008] 因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種治療受治者的細胞內感染的方法，所述方法 包括給藥受治者IAP詰抗劑。
【附圖說明】
[0009] 圖1顯示了8周時間內受感染小鼠的血清中血清HBV DNA水平的時間過程（上幅 圖）。下幅圖顯示了血清中病毒粒子(左)和亞病毒顆粒(右）的EM顯微照片。
[001 0]圖2顯示了40周時間內受感染小鼠的血清中的血清HBV DNA水平的時間過程。盡管 表面上控制住了病毒血癥，但甚至在感染后24周，受感染小鼠在HBV病毒的復制上顯示出了 復發(fā)，其在血清HBV DNA水平上具有短暫的尖峰。
[0011 ] 圖3顯示了用Birinapant或載體對照（DMSO)處理的小鼠的HBV DNA的血清水平。
[0012] 圖4顯示了比較Birinapant與載體對照處理的（C57BL/6)HBV受感染小鼠的時間- 事件（time to event)(HBV清除）圖。
[0013] 圖5顯示了ClAPl缺乏(肝特異性缺乏)并且所有器官完全CIAP2缺乏的小鼠，可將 HBV感染清除至與用Birinapant治療的野生型小鼠類似的程度。虛線、紅色實線和藍色實線 分別代表了隨時間過去清除感染的野生型小鼠、肝臟特異性cIAPl缺乏加全身cIAP2缺乏的 小鼠和XIAP缺乏(全身）的小鼠的數(shù)目（％ )。
[0014] 圖6用Birinapant抑制PBMC中HIV-I JR-CSF的復制。
[0015] 圖7用Birinapant+10ng/ml TNF-α抑制PBMC中HIV-I JR-CSF的復制。
[0016]圖8.使PHA活化的PBMC(分離自兩位健康的捐贈者）未受到或受到HIV NL4.3(GFP + )感染，之后用指定濃度的Birinapant或載體對照（NT)處理6小時或24小時。另外，用 Birinapant或載體對照來處理未感染的原始PBMC。流式細胞儀(FACS)分析了相對于處理之 前存活的受感染細胞，24小時Birinapant處理之后存活的（活性半胱天冬酶3(Caspas e 3) 陰性)a)HIV感染的(GFP+)培養(yǎng)的CD4+淋巴細胞的比例；相對于未處理的細胞，6小時或24小 時Birinapant處理之后存活的b)原始培養(yǎng)的或c)PHA活化的、未感染的⑶4+淋巴細胞的比 例。
[0017] 圖9相比于DMSO對照（η= 15)，用Birinapant處理的結核分支桿菌受感染小鼠 （η = 17，腹膜內注射給藥，30yg/g每周一次X 3次）中，結核分支桿菌的載菌量(CFU/肺，Log1Q)，顯 示出顯著的降低，為0.331^1(^1]/肺(？ = 0.012)。
[0018]圖10詰抗性的TNF-α細胞因子抵消了 birinipant的效力。
[0019] 圖11用與birinipant不同的SMAC模擬物進行實驗的結果。
[0020] 圖12給藥birinipant(正方形）或載體對照（圓形）的受感染小鼠的肺中的嗜肺軍 團菌（Legionella pneumophila)的載菌量（CFU/ml)。每個點代表一個動物，誤差棒代表 SEM〇*P〈0.05〇
[0021] 圖13顯示了用恩替卡韋、birinipant與恩替卡韋的結合處理HBV受感染小鼠的結 果。林*ρ〈0·001、林p〈0.01、ns =不顯著。
[0022] 圖14顯示了利用具有TRAIL、birinipant和TRAIL與birinipant的結合的腺病毒傳 輸系統(tǒng)處理體外感染HBV的原代人肝細胞的結果。
【具體實施方式】
[0023] 在本說明書中，除非上下文有另外的規(guī)定，否則應當將詞語"包括"或其形態(tài)變化 (如"包含"或"含有"）理解為包含確定的要素或整體或者要素或整體的組，但并不排除任何 另外的要素或整體或者要素或整體的組。
[0024] 本說明書中提及的任何在先專利公開(或從其中獲得的資料)或任何已知的材料， 不被且不應當被看作是對在先專利公開(或從其中獲得的資料)或已知的材料構成了涉及 本說明書嘗試的領域的普遍公知的部分的承認或認可或任何形式的意見。
[0025] 本說明書中提及的所有專利公開均以引用的方式并入本文中。
[0026] 應當注意的是，如本說明書中所使用的，單數(shù)形式的"一(a)"、"一(an)"和"所述 (the)"包括復數(shù)方面，除非上下文明確地規(guī)定了例外的情況。因此，例如，提及的"試劑(an agent)"包括單一的試劑，也包括兩種以上的試劑;提及的"分子(a molecular)"包括單一 的分子，也包括兩種以上的分子;如此等等。
[0027] 根除病原體的機理是使受感染細胞激活程序性細胞死亡過程。這樣殺死了病原體 和受感染細胞，并防止了微生物的蔓延。然而，許多病原體發(fā)展出了對策來防止它們的宿主 細胞自殺。宿主細胞中的一組分子，被稱作細胞凋亡蛋白抑制劑（IAPs)，在調節(jié)細胞死亡程 序和在控制炎癥方面具有若干作用。
[0028]在某種程度上，本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn):通過體內拮抗IAPs，增強了對持續(xù)感染的宿 主細胞的肅清和對病原體的消除，而不會導致對宿主的明顯危害性的間接損害。這可通過 使用pan-I AP拮抗劑(其可以是pan-c IAP拮抗劑，例如，c IAP1和/或c IAP2拮抗劑)來實現(xiàn)。
[0029] 因此，第一方面，本發(fā)明提供了一種治療受治者的細胞內感染的方法，所述方法包 括給藥受治者IAP詰抗劑。
[0030] 這里所使用的術語"治療"的意思是減小了受治療的生物(例如，人類患者）的造成 細胞內感染的病原體的水平或數(shù)量。
[0031] IAP的蛋白質家族包括:XIAP(BIRC4)、cIAPl(BIRC2)、cIAP2
[0032] (81此3);嫩1卩（811?(：1)、存活素（51^￥1￥111)(811^5)、厶？〇11〇11(8^1。6 ;811^6)、]^-IAP(BIRC7;Livin，KIAP)和ILP2(BIRC8)。家族成員之間存在著一定程度的重復，但XIAP+ cIAPl+cIAP2的標靶化合物缺失導致了小鼠早期胚胎的致死性。這些分子加重了炎癥并終 止細胞發(fā)出死亡信號1。本發(fā)明的發(fā)明人第一次證實了 IAPs在維持宿主的持續(xù)細胞內感染 方面起到重要作用。
[0033] 在一個實施方式中，所述IAP為cIAPl或cIAP2,或二者。
[0034] cIAPl由GenBank DQ068066.1所示的序列來編碼。cIAPl的轉錄變體包括NCBI參考 序列 ΝΜ_001166·4、ΝΜ_001256163·1 和ΝΜ_001256166·1。
[0035] cIAP2由GenBank BC037420.1所示的序列來編碼。cIAP2的轉錄變體包括NCBI參考 序列 ΝΜ_001165 · 4 和ΝΜ_182962 · 2。
[0036] ΧΙΑΡ(Χ連鎖凋亡抑制劑）由GenBank NCBI參考序列NG_007264.1來編碼。XIAP的轉 錄變體包括 NCBI參考序列 NM_001167.3、NM_001204401.1 和NR_037916.1。
[0037] 適宜的IAP拮抗劑應當是本領域的技術人員已知的。其實例包括單價的IAP拮抗劑 GDC-0145、⑶ C-0152 和⑶ C-0917(美國 Genentech 公司），AT-IAP(英國 Astex 公司）和 AT-406 (美國Ascenta公司），以及二價的IAP詰抗劑AEG40826(美國Aegera Therapeutics公司）、 SM-1200(密歇根大學）、HGS1029(美國人類基因組科學公司（Human Genome Sciences))、 BV6(美國Genentech公司）、AEG40730(Aegera Therapeutics公司）；SM_164(密歇根大學）； CS3(Genentech公司）；MLlO 1 (桑福德-伯納姆（Sanford-Burnham)醫(yī)學研究所）；AEG35156 (Aegera Therapeutics公司）和birinapant/TL32711 (美國TetraLogic公司）。這些IAP詰抗 劑中的幾個在Fulda和Vucic(Nature Reviews Drug Discovery，2012，volll, 109-124)以 及Fulda(Leukemia, 2012, vol26,1155-1165)中進行了進一步討論，這兩篇文獻的內容以引 用的方式并入本文中。盡管目前認為單價和二價IAP拮抗劑均能被用于本發(fā)明中，但現(xiàn)在優(yōu) 選所述IAP拮抗劑是二價的。
[0038]在一個實施方式中，所述IAP拮抗劑為第二線粒體源半胱天冬酶活化因子(Smac) 的模擬物。Smac是為IAPs的內源抑制劑的促凋亡線粒體蛋白。Smac模擬物已被證實激發(fā)了 程序性細胞死亡，因而在開發(fā)新的癌癥療法中成為了焦點 2,3。
[0039] Smac通過與IAPs的直接相互作用而詰抗了IAP介導的半胱天冬酶抑制，和/或引發(fā) 了IAP家族(cIAPl和cIAP2)的某些成員的蛋白酶體降解。Smac同時促進半胱天冬酶-3酶原 (pro-caspase-3)的蛋白水解活化作用和成熟的半胱天冬酶-3的酶活性的能力依賴于其與 IAP特異性相互作用的能力。Smac結合至XIAP的BIR1/BIR2連接子區(qū)域和BIR3，干擾了半胱 天冬酶-3和-7以及半胱天冬酶-9的抑制，因而促進了細胞凋亡或程序性細胞死亡。Smac和 Smac模擬物還引發(fā)了 cIAPl和cIAP2的蛋白酶體降解，導致了經(jīng)典NF-kB激活的抑制。許多病 毒調節(jié)NF-κΒ激活以促進疾病的發(fā)病(參考文獻:Rahman and McFadden,Nat Rev Microbio 20119:291-306；Hiscott et al Oncogene 2006 30:6844-67；Shukla et al Carcinogenesis 201132:978-985)。不受限于對構成本發(fā)明基礎的機理的具體理解，這些 活性暗示了 Smac模擬物可被用于治療這些感染的機理。
[0040] 通過闡明Smac與IAPs之間的相互作用的晶體結構，使得Smac模擬物的發(fā)現(xiàn)成為可 能。Smac模擬物似乎通過多重機理促進了腫瘤細胞中的凋亡性細胞死亡，所述機理包括:直 接結合并詰抗IAPs、通過促進cIAPs的自動泛素化(autoubiquitylation)和蛋白酶體降解 而消除IAPs以及通過TNF激發(fā)而激活細胞外凋亡途徑。TNF是控制許多感染所需的關鍵細胞 因子，并且當TNF被拮抗時，為了治療自身免疫紊亂，許多潛在的感染被再次激活（參見 http://cmr.asm.Org/content/22/2/274.full#sec_49)。作為推論，在這些感染中提高TNF 的活性可促進它們的肅清。
[0041] Smac肽模擬物的實例，包括某些上文所指出的，被非限制性地公開在下列文獻中： US 7,517,906、US 7,419,975、US 7,589，118、US 7,932,382、US 7,345,081、US 7,244， 851、US 7,674,787、US 7,772，177、US 7,989,441、US20100324083、US20100056467、 1^20090069294、1^20110065726、1]520110206690和102011098904，所有這些文獻以引用的 方式并入本文中，如同做出了充分的闡述一樣。在這些文獻中公開的化合物，以及常規(guī)Smac 模擬物，具有如下結構：
[0042] [P1-P2-P3-P4](式I)
[0043] 或者
[0044] [P1-P2-P3-P4]-L-[P1，-P2，-P3，-P4，](式II)
[0045] 其中，P1-P2-P3-和ΡΓ-Ρ2'-Ρ3'_對應于成熟Smac的N端丙氨酸(Ala)-纈氨酸 (Val)-脯氨酸(Pro)-三肽的肽置換物（即肽模擬物），以及Ρ4和Ρ4'對應于第四N端氨基酸苯 丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、異亮氨酸（lie)或纈氨酸(Val)的氨基酸置換物，以及L為共價 連接[PI-P2-P3-P4 ]與[PΓ -P2 ' -P3 ' -P4 ' ]的連接基團或連接鍵。
[0046] 例如，非限制性的，Smac模擬物可存在于以下類型的式II的化合物中：
[0047] Pl 和PrSNHR1-CHR2-C(O)-;
[0048] P2 和 P2,為-NH-CHR3-C(O)-;
[0049] P3和P3'為四氫吡咯、稠合環(huán)烷基的四氫吡咯或稠合具有N雜原子的雜環(huán)烷基的四 氫吡咯，它們在各個情況下可任選被取代，并且其中P3/P3 '的四氫吡咯通過酰胺鍵與P2/ P2'相結合；
[0050] P4 和 P4,為-M-Qp-R7。
[0051] 可變的取代基可以是，例如，
[0052] 妒：-!1或-〇13;
[0053] R2:-CH3、-CH2CH3或-CH20H;
[0054] R3:C2-6烷基、C2-6烷氧基、C3-C6環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、或C6-C8芳基或雜芳基，它們 在各個情況下可任選被取代；
[0055] M:共價鍵、C1-6亞烷基、取代的C1-C6亞烷基(例如但不限于-C(O)-);
[0056] Q:共價鍵、Cl -6亞烷基、取代的Cl -C6亞烷基、-0-或-NR8-;
[0057] 卩：〇或1;
[0058] R7:環(huán)烷基、環(huán)烷基芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、芳基或雜芳基，它們在各個情況 下可任選被取代；
[0059] r8:_hsc1_6 烷基。
[0060] L為共價連接[P1-P2-P3-P4]與[?1'-?2'-?3'-?4']的連接基團或連接鍵。
[0061] "烷基"（一價)和"亞烷基"（二價)在單獨或作為另一術語(例如，烷氧基)的一部分 時，意思是指支鏈或非支鏈的飽和脂肪烴基，且除非另有說明，否則其含有至多12個碳原 子。具體的烷基的實例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、 叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2_二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、2,2_二甲基丁基、正庚 基、3-庚基、2-甲基己基等。術語"低級的"，用于修飾烷基、烯基等時，意思是指1至4個碳原 子、支鏈或直鏈的，從而，例如，術語"低級烷基"、"C 1-C4烷基"和"1至4個碳原子的烷基"的意 思相同，且可互換使用以表示甲基、乙基、1-丙基、異丙基、1-丁基、仲丁基或叔丁基。亞烷基 的實例包括但不限于:亞甲基、亞乙基、正亞丙基、正亞丁基和2-甲基-亞丁基。
[0062] 術語取代烷基指的是具有取代了烴骨架的一個或多個(通常不超過四個)碳原子 上的一個或多個氫的取代基的烷基部分。這些取代基相互獨立地選自：鹵素(例如，I、