一種用于治療糖尿病的干細胞制劑及其制備方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于干細胞研究領域，具體是一種用于治療糖尿病的干細胞制劑及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種因體內(nèi)膜島素絕對或者相對不足所導致的一系列臨床綜合癥，主要 包括I型和II型糖尿病。近年來，糖尿病發(fā)病率呈上升趨勢，而且更趨年輕化。預計到2025 年，世界范圍內(nèi)將有3. 34億人次患有糖尿病，糖尿病已成為威脅人類健康的一大頑疾。不 同類型的糖尿病都會導致膜腺中的目細胞不能產(chǎn)生足量的膜島素 W降低血糖的濃度，導 致高血糖癥的發(fā)生。目前的治療方法中，藥物治療雖然能有效降低血糖，但不能有效修復膜 島功能；注射膜島素雖能控制癥狀、延緩和減少并發(fā)癥的發(fā)生，卻不能使糖尿病徹底治愈， 且長期使用膜島素會產(chǎn)生諸如失明、腎衰、肥胖等嚴重的并發(fā)癥W及產(chǎn)生膜島素抵抗，另外 每天注射膜島素本身也給患者帶來極大的痛苦，給患者、家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔； 膜島細胞移植雖然是一個有效的治療策略，然而面臨的問題依然是供體缺乏及免疫排斥等 醫(yī)學與倫理學問題。
[0003] 近年來，干細胞研究為各種疾病的治療提供了一種新的手段。干細胞是原始且未 充分分化的細胞，具有再生各種組織器官的潛在功能，因而為組織器官的再造移植和重大 疾病的治療提供了希望。間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs)起源于中胚層， 在骨髓、廝帶、廝血、脂肪等多種組織和器官中均可分離獲得，具備干細胞的自我擴增和多 向分化性，在發(fā)育的不同階段和特定環(huán)境條件下，能分化為多種間質(zhì)起源的組織細胞，如成 骨、軟骨和脂肪細胞，也能橫向分化為肌細胞、神經(jīng)細胞、血管內(nèi)皮細胞、肝膜細胞等多種其 他組織細胞。MSCs兼具再生、修復和免疫調(diào)節(jié)等多方面的作用。廝帶來源的間充質(zhì)干細胞 (Umbilical-Derived Mesenchymal Stem Cells, UMSCs)是存在于廝帶沃頓膠和血管周圍 組織中的間充質(zhì)干細胞，與來源于骨髓的間充質(zhì)干細胞相比，UMSCs具有更加顯著的優(yōu)勢， 包括；采集方便為無創(chuàng)性操作；來源于胎兒廝帶的間充質(zhì)干細胞比成人骨髓間充質(zhì)干細胞 更幼稚，增殖和分化潛能更大；廝帶來源豐富，可W進行規(guī)?；a(chǎn)。送些優(yōu)勢使其在治療 糖尿病方面展現(xiàn)出更廣闊的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有治療糖尿病方法的不足，W及獲取干細胞過程中涉及到的來源受限和 倫理問題，本發(fā)明提供一種用于治療糖尿病的干細胞制劑及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明為實現(xiàn)其目的所采用的技術(shù)方案是：
[0006] -種用于治療糖尿病的干細胞制劑，該干細胞制劑包含從人廝帶中分離提取的間 充質(zhì)干細胞，該間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導后能夠分化成膜島目細胞。
[0007] 進一步的，所述間充質(zhì)干細胞的細胞表面標記CD73、CD90、CD105的表達均高于 95%，細胞表面標記CD14、CD34、CD45、CD19和HLA-DR的表達均低于3%。
[0008] 進一步的，所述間充質(zhì)干細胞是在分離提取后進一步經(jīng)體外傳代培養(yǎng)的干細胞。
[0009] 進一步的，所述間充質(zhì)干細胞在顯微鏡下呈長梭形，包漿透亮，胞體小，有立體感。
[0010] 進一步的，所述間充質(zhì)干細胞具有向成骨方向分化和向成脂方向分化的多向分化 潛能。
[0011] 一種制備所述的用于治療糖尿病的干細胞制劑的方法，包括W下步驟：
[0012] (1)從廝帶中分離提取間充質(zhì)干細胞；
[0013] (2)間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)；
[0014] (3)間充質(zhì)干細胞的傳代培養(yǎng)；
[0015] (4)將步驟（3)獲得的間充質(zhì)干細胞制成干細胞制劑；
[0016] (5)干細胞制劑的質(zhì)量檢測。
[0017] 進一步的，所述間充質(zhì)干細胞的分離提取包括W下步驟；在超凈工作臺中操作，將 新鮮獲取的廝帶用己醇進行消毒，再用生理鹽水清洗廝帶，分離剝除廝帶血管，獲得華通氏 膠部分。
[0018] 進一步的，所述間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)包括W下步驟：將華通氏膠剪碎，稀釋后 種瓶，在二氧化碳培養(yǎng)箱中采用組織貼壁法培養(yǎng)，通過全量換液逐漸去除未貼壁細胞，待細 胞融合度達到70-80%即可收獲原代細胞。
[0019] 進一步的，所述干細胞制劑的質(zhì)量檢測包括細菌、真菌、支原體、病毒、內(nèi)毒素、熱 源檢測及細胞活性檢測。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是；本發(fā)明W廝帶為干細胞的來源，經(jīng)過提取分離、原代培養(yǎng)、 傳代培養(yǎng)并制成干細胞制劑，利用流式細胞儀檢測細胞的表面標記證明送是一類低免疫原 性的干細胞，通過實驗表明所得間充質(zhì)干細胞能夠增殖、具有多向分化潛能，最重要的是， 它能夠誘導分化成膜島目細胞，從而用于治療糖尿病。本發(fā)明制劑中的干細胞來自廝帶， 采集方便，為無創(chuàng)性操作；所得間充質(zhì)干細胞比其他的間充質(zhì)干細胞更幼稚，增殖和分化潛 能更大；廝帶來源豐富，可W進行規(guī)?；a(chǎn)；不受倫理限制，免疫原性低，在治療糖尿病 領域具有非常廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0021] 圖1是廝帶來源間充質(zhì)干細胞的原代細胞。
[0022] 圖2是第二代廝帶來源間充質(zhì)干細胞。
[0023] 圖3是廝帶來源間充質(zhì)干細胞的細胞表面標記的檢測結(jié)果。
[0024] 圖4是廝帶來源間充質(zhì)干細胞的細胞的增殖曲線。
[0025] 圖5是廝帶來源間充質(zhì)干細胞向成脂方向分化的染色鑒定。
[0026] 圖6是廝帶來源間充質(zhì)干細胞向成骨方向分化的染色鑒定。
[0027] 圖7是動物模型中，四組小鼠在第Η天的空腹血糖的檢測結(jié)果。
[002引圖8是動物模型中，四組小鼠的血糖水平監(jiān)測結(jié)果。
[002引圖9是動物模型中，四組小鼠的膜島素水平監(jiān)測結(jié)果。
【具體實施方式】 [0030] 實施例1
[0031] 廝帶來源的間充質(zhì)干細胞制劑的制備
[0032] 在超凈工作臺中操作，將新鮮獲取的廝帶用己醇進行消毒，再用生理鹽水清洗廝 帶，分離剝除廝帶血管，獲得華通氏膠部分，將華通氏膠剪碎，稀釋后種瓶，在二氧化碳培 養(yǎng)箱中采用組織貼壁法培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞生長情況，可W看到細胞貼壁生長，呈長梭 形，包漿透亮，胞體較小，有立體感，通過全量換液逐漸去除未貼壁細胞，待細胞融合度達到 70-80%即可收獲原代細胞，結(jié)果見圖1 ;將所得原代細胞在DMEM培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)， W達到純化和擴增培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的目的，結(jié)果見圖2 ;收集第3~8代間充質(zhì)干細胞， 制成干細胞制劑，低溫凍存。
[003引 實施例2
[0034] 廝帶來源的間充質(zhì)干細胞的表面標記研究
[0035] 利用流式細胞儀檢測細胞表面標記，結(jié)果見圖3。同MSCs相關的細胞表面標記 CD73、CD90、CD105呈高表達，各個代次的表達都穩(wěn)定，均高于95% ;同造血細胞相關的細胞 表面標記CD14、CD34、CD45、CD19 W及同免疫排斥相關的HLA-DR表達低，均低于3%。證明 多次傳代后廝帶來源的MSCs含有能穩(wěn)定增殖的干細胞，細胞高表達MSCs相關的標記，不表 達或低表達造血細胞和與移植排斥相關的細胞表面標記，提示此類MSCs細胞是一類低免 疫原性的干細胞，可能在抗自體免疫疾病，治療移植后排斥方面起到作用。
[003引 實施例3
[0037] 廝帶來源的間充質(zhì)干細胞的增殖研究
[0038] 將傳代細胞種植于96孔板中，分12組，每組7孔，每孔加入細胞懸液200 μ 1。隨 機取傳代培養(yǎng)細胞，根據(jù)Μ?Τ