口炎清活性成分群及其指紋特征圖譜的構(gòu)建和質(zhì)量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及口炎清制劑的活性成分分析及質(zhì)量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥的生物活性評(píng)價(jià)與其安全性、有效性直接相關(guān)，中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥 中與生物活性密切相關(guān)的化學(xué)成分群，因此對(duì)中藥的生物活性成分的研究，闡明其藥效物 質(zhì)基礎(chǔ)是促進(jìn)中藥發(fā)展和應(yīng)用的必經(jīng)之路。早在2004年，美國FDA的《植物藥研制指導(dǎo)原則》 就明確指出，研究植物藥應(yīng)在已知成分的基礎(chǔ)上提高和藥物作用的研究，運(yùn)體現(xiàn)了對(duì)中藥 的生物活性成分監(jiān)控的重要性，表明對(duì)中藥生物活性成分的研究已成為中藥走向現(xiàn)代化的 關(guān)鍵技術(shù)。將含有化學(xué)特征信息的中藥指紋圖譜與藥效相關(guān)聯(lián)，分析化學(xué)成分變化與藥效 變化的關(guān)聯(lián)性，能夠科學(xué)地掲示生物活性成分，闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，是中藥質(zhì)量控制的一個(gè) 重大進(jìn)步，在加速中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
[0003] 口炎清顆粒是由廣州白云山和記黃捕中藥有限公司獨(dú)家生產(chǎn)的治療口腔炎癥疾 病的超億元中成藥。該產(chǎn)品由山銀花、玄參、麥冬、天冬、甘草5味藥材組成，可滋陰清熱、解 毒消腫，臨床用于治療陰虛火旺的口腔炎癥疾病，對(duì)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍、口腔黏膜炎、口腔扁 平苔薛、碟口瘡等多種口腔黏膜疾病均有良好療效?？谘浊孱w粒收錄在《國家基本藥物目 錄》(2012年版），是6個(gè)治療咽喉、口腔病的國家基本用藥之一。自1989年上市銷售后，口炎 清顆粒臨床用藥效果顯著，安全性高，一直深受醫(yī)生和患者歡迎，帶來了很大的社會(huì)效益和 經(jīng)濟(jì)效益。
[0004] 口炎清顆粒HPLC指紋圖譜技術(shù)于2012年獲得國家發(fā)明專利授權(quán)，公開號(hào)為 101518616B。該指紋圖譜共檢出23個(gè)共有峰，確證了7個(gè)已知成分，同時(shí)監(jiān)測(cè)了山銀花、玄 參、甘草3味藥材，但麥冬和天冬的相關(guān)特征成分研究尚未完善。該指紋圖譜方法不足之處 在于：（1)指紋圖譜所提供的化學(xué)信息及化學(xué)解釋均較少，共檢出23個(gè)共有峰，確證了 7個(gè)已 知成分，僅監(jiān)測(cè)了山銀花、玄參、甘草3味藥材，而未檢測(cè)麥冬和天冬的相關(guān)特征成分。（2)指 紋圖譜中的各特征峰所對(duì)應(yīng)化學(xué)成分的生物活性不明確，不能有效監(jiān)控口炎清顆粒有效成 分含量，無法確保產(chǎn)品的安全性及有效性。
[000引綜上所述，現(xiàn)有口炎清顆粒指紋圖譜構(gòu)建方法尚存在較多不足，在進(jìn)一步完善其 化學(xué)信息的基礎(chǔ)上，需重點(diǎn)關(guān)注其中的核屯、活性成分群，并完善質(zhì)量檢測(cè)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，用超快速高效液相色譜儀與四級(jí) 桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀串聯(lián)檢測(cè)技術(shù)對(duì)口炎清制劑抗炎藥效的活性成分進(jìn)行分析，進(jìn)一步構(gòu) 建了指紋特征圖譜和活性成分群，并提供了相關(guān)質(zhì)量檢測(cè)方法。
[0007] 口炎清制劑抗炎藥效的活性成分的分析及其指紋特征圖譜的構(gòu)建方法，包括W下 步驟：
[0008] (1)通過體外炎癥模型篩選抗炎藥效學(xué)檢測(cè)指標(biāo)；
[0009] (2)在口炎清制劑配方比例約束下，W五味原藥材的質(zhì)量百分含量為五個(gè)因素，均 勻設(shè)計(jì)構(gòu)建若干口炎清制劑差異樣品；
[0010] (3似補(bǔ)骨脂素為內(nèi)標(biāo)校正，用超快速高效液相色譜儀與四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 串聯(lián)技術(shù)，獲得所述差異樣品及原配方口炎清制劑已確證化學(xué)成分的相對(duì)峰面積，構(gòu)建指 紋特征圖譜；
[0011] (4)針對(duì)步驟（1)所篩選的抗炎藥效學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，分別獲得所述差異樣品的抗炎藥 效特征數(shù)據(jù)；
[0012] (5)利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法綜合分析步驟(3)所述化學(xué)成分與各差異樣品抗炎藥效差 異的關(guān)聯(lián)性，確定所述口炎清制劑抗炎藥效活性成分群。
[0013] 所述的抗炎藥效學(xué)檢測(cè)指標(biāo)分別為促炎因子TNF-a、比-8、比-6、比-10的含量。
[0014] 口炎清制劑差異樣品的若干數(shù)量應(yīng)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，科學(xué)合理反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0015] 所述步驟(5)中具體方法為W步驟(3)所指證的特征峰的相對(duì)峰面積為自變量，W 差異樣品的抗炎藥效為因變量，利用灰色關(guān)聯(lián)分析或主成分分析或偏最小二乘法綜合分析 兩變量間關(guān)聯(lián)性，W確定所述口炎清制劑抗炎藥效活性成分群。
[0016] 其中，步驟(3)所述日炎清制劑差異樣品進(jìn)樣品的制備方法為:按照《中華人民共 和國藥典》2010年版口炎清顆粒標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)工藝制備各差異樣品浸膏;取適量浸膏加入50% 甲醇9mL，超聲30min，補(bǔ)充50 %甲醇定容至IOmL，經(jīng)0.22皿微孔濾膜過濾后，用50 %甲醇稀 釋，使終濃度為0.15g/mL，得目標(biāo)樣品；
[0017] 所述技術(shù)的檢測(cè)條件為:采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，ISOmmX 4.6mm，3皿，柱溫40°C; WO. 1 %甲酸乙臘溶液-0.1 %甲酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，0-7分 鐘，0.1 %甲酸乙臘溶液由2%變至10%，7-95分鐘，0.1 %甲酸乙臘溶液由10%-41 % ,95-105分鐘，0.1 %甲酸乙臘溶液由41%變至100% ,105-115分鐘，0.1%甲酸乙臘溶液為 100%，流速為0.3mL/min;進(jìn)樣量為扣L，質(zhì)譜工作參數(shù):離子噴霧電壓為5500V;離子源氣體 1為55psi ;離子源氣體2為55psi ;溫度為550°C;氣簾氣為35psi ;碰撞氣體壓力為IOpsi ;采 用ESI電噴霧離子源，正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。
[0018] 在上述檢測(cè)條件下，共檢出相對(duì)峰面積大于1.5%的38個(gè)特征峰，指紋特征圖譜如 圖2所示;確證1號(hào)峰為賴氨酸、2號(hào)峰為精氨酸、4號(hào)峰為天冬氨酸、5號(hào)峰為瓜氨酸、8號(hào)峰為 白屈菜酸、10號(hào)峰為酪氨酸、11號(hào)峰為苯丙氨酸、12號(hào)峰為哈己巧、14號(hào)峰為綠原酸、16號(hào)峰 為咖啡酸、17號(hào)峰為甘草巧、18號(hào)峰為異搬皮巧、19號(hào)峰為木犀草巧、23號(hào)峰為安格洛巧C、 24號(hào)峰為異甘草巧、27號(hào)峰為哈己俄巧、28號(hào)峰為肉桂酸、29號(hào)峰為灰拉毛忍冬皂巧乙、31 號(hào)峰為川續(xù)斷皂巧乙、32號(hào)峰為甘草次酸、33號(hào)峰為甘草酸、35號(hào)峰為費(fèi)奠皂巧元、36號(hào)峰 為甲基麥冬二氨高異黃酬A、37號(hào)峰為魯斯可皂巧元、38號(hào)峰為麥冬皂巧D;3號(hào)峰為k天冬 酷胺、6號(hào)峰為T-氨基下酸、7號(hào)峰為脯氨酸、9號(hào)峰為焦谷氨酸、13號(hào)峰為新綠原酸、15號(hào)峰 為隱綠原酸、20號(hào)峰為3,4-二咖啡酷奎尼酸、21號(hào)峰為3,5-二咖啡酷奎尼酸、22號(hào)峰為4,5-二咖啡酷奎尼酸、25號(hào)峰為W費(fèi)奠皂巧元為巧元的皂巧1、26號(hào)峰為W費(fèi)奠皂巧元為巧元的 皂巧2、30號(hào)峰為灰拉毛忍冬次皂巧甲、34號(hào)峰為甘草寧B。
[0019] 再W檢出的38個(gè)特征峰的相對(duì)峰面積為自變量，W差異樣品的抗炎藥效為因變 量，利用灰色關(guān)聯(lián)分析或主成分分析或偏最小二乘法綜合分析兩變量間關(guān)聯(lián)性，構(gòu)建口炎 清制劑抗炎藥效活性成分的指紋特征圖譜如圖4所示;包括29個(gè)特征峰，其中1號(hào)峰為賴氨 酸、2號(hào)峰為精氨酸、3號(hào)峰為天冬氨酸、4號(hào)峰為丫-氨基下酸、5號(hào)峰為脯氨酸、6號(hào)峰為白屈 菜酸、7號(hào)峰為焦谷氨酸、8號(hào)峰為酪氨酸、9號(hào)峰為苯丙氨酸、10號(hào)峰為哈己巧、11號(hào)峰為新 綠原酸、12號(hào)峰為綠原酸、13號(hào)峰為隱綠原酸、14號(hào)峰為咖啡酸、15號(hào)峰為甘草巧、16號(hào)峰為 異搬皮巧、17號(hào)峰為木犀草巧、18號(hào)峰為3,4-二咖啡酷奎尼酸、19號(hào)峰為3，5-二咖啡酷奎尼 酸、20號(hào)峰為4,5-二咖啡酷奎尼酸、21號(hào)峰為安格洛巧C、22號(hào)峰為異甘草巧、23號(hào)峰為哈己 俄巧、24號(hào)峰為肉桂酸、25號(hào)峰為甘草次酸、26號(hào)峰為甘草寧B、27號(hào)峰為甲基麥冬二氨高異 黃酬A、28號(hào)峰為魯斯可皂巧元、29號(hào)峰為麥冬皂巧D。
[0020] 確定其活性成分群為29個(gè)分別為:賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丫-氨基下酸、脯氨 酸、白屈菜酸、焦谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、哈己巧、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、 甘草巧、異搬皮巧、木犀草巧、3，4-二咖啡酷奎尼酸、3，5-二咖啡酷奎尼酸、4，5-二咖啡酷奎 尼酸、安格洛巧C、異甘草巧、哈己俄巧、肉桂酸、甘草次酸、甘草寧B、甲基麥冬二氨高異黃酬 A、魯斯可皂巧元及麥冬皂巧D。
[0021] W上活性成分的指紋特征圖譜可應(yīng)用于口炎清制劑的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于 包括W下步驟：
[0022] (1)對(duì)照品溶液的制備:取精氨酸、綠原酸、木犀草巧、魯斯可皂巧元對(duì)照品適量， 加50%甲醇制成每ImL含綠原酸50yg，精氨酸、木犀草巧、魯斯可皂巧元各化g的對(duì)照品溶 液；
[0023] (2)供試品溶液制備:分別稱取待測(cè)口炎清制劑樣品1.3g，置具塞錐形瓶中，加入 50 %甲醇IOmL，精密稱定，超聲30min，放置至室溫，加50 %甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，經(jīng)0.22皿微 孔濾膜過濾后即得；
[0024] (3)運(yùn)用超快速高效液相色譜儀與四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀串聯(lián)對(duì)上述對(duì)照品及 供試品進(jìn)行檢測(cè)并分別構(gòu)建圖譜；
[00巧]檢測(cè)條件：色譜柱：Dionex Bonded Silica C18(3皿，150mmX4.6mm)，柱溫40°C; 流動(dòng)相:A為0.1 %甲酸乙臘溶液，B為0.1 %甲酸水溶液j$0-7min(2-10%A)，7-95min(10-41%4)，95-105111111(41-100%4)，105-115111111(100%4)的梯度洗脫;進(jìn)樣量扣1^;流速0.3血/ min；
[0026] 質(zhì)譜工作參數(shù)：離子噴霧電壓為5500V;離子源氣體1為55psi;離子源氣體2為 55psi;溫度為550°C;氣簾氣為35psi;碰撞氣體壓力為lOpsi。采用ESI電噴霧離子源，正離 子模式進(jìn)行檢測(cè)；
[0027] 所述的指紋特征圖譜如圖4所示為對(duì)照特征圖譜，供試品圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)29個(gè)與對(duì) 照特征圖譜相對(duì)應(yīng)的色譜峰，其中2、12、17、28號(hào)峰的保留時(shí)間應(yīng)與精氨酸、綠原酸、木犀草 巧、魯斯可皂巧元對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間相對(duì)應(yīng);其余色譜峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照特征 圖譜相應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間一致為合格品。
[0028] 本發(fā)明所述的口炎清制劑是W藥典口炎清顆粒處方為基礎(chǔ)，凡W 口炎清顆粒處方 為基本組分，相似藥效的任何類型制劑的半成品或產(chǎn)品均適合本發(fā)明的所述的分析方法及 質(zhì)量檢測(cè)方法，均屬于本發(fā)明所保護(hù)的范圍之內(nèi)。本技術(shù)的實(shí)施應(yīng)用可為其他中藥復(fù)方制 劑的研究提供范例。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1)采用超快速高效液相色譜儀與四級(jí) 桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀串聯(lián)化化C-Q-T0F-MS/MS)技術(shù)研究口炎清制劑的化學(xué)成分，確證了指 紋圖譜中25個(gè)化學(xué)成分，比原專利技術(shù)多確證了 18個(gè)化學(xué)成分；（2)篩選穩(wěn)定、靈敏的藥效 學(xué)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)口炎清差異樣品進(jìn)行考察，更全面、客觀科學(xué)和直接地反映藥品的藥效作用 特點(diǎn)；（3)本發(fā)明中利用香煙煙霧提取物刺激口腔黏膜角化細(xì)胞建立體外炎癥模型進(jìn)行藥 效學(xué)實(shí)驗(yàn)，該模型靈活、快速、實(shí)驗(yàn)周期短，是抗炎藥物藥效篩選實(shí)驗(yàn)常用模型；（4)本發(fā)明 中綜合運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法如灰色關(guān)聯(lián)分析、主成分分析、偏最小二乘法等方法進(jìn)行譜效分 析，有效避免自變量間共線性，分析結(jié)果直觀、真實(shí)、可靠；（5)通過譜效結(jié)合分析明確了口 炎清制劑核屯、抗炎活性成分群，闡明了其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，有效結(jié)合了指紋圖譜化學(xué)信息與 生物學(xué)信息，有利于提高其安全性、有效性及質(zhì)量均一性。（6)用于口炎清制劑的質(zhì)量檢測(cè) 更快捷和有效。
【附圖說明】
[0030]圖1是口炎清制劑原配方及差異樣品1-11號(hào)的UFLC-Q-T0F-MS/MS圖譜；
[0031 ]圖2是口炎清制劑抗炎活性成分群的UFLC-Q-T0F-MS/MS指紋特征圖譜，圖中標(biāo)女 為內(nèi)標(biāo)補(bǔ)骨脂素；
[0032]圖3是口炎清制劑抗炎藥效活性成分的指紋特征圖譜；
[0033 ]圖4是圖3中1號(hào)到6號(hào)特征峰的局部放大圖；
[0034] 圖5是圖3中7號(hào)到10號(hào)特征峰的局部放大圖；
[0035] 圖6是圖3中21號(hào)特征峰的局部放大圖；
[0036] 圖7是圖3中23到27號(hào)特征峰的部分放大圖；
[0037] 圖8是圖2的1號(hào)到26號(hào)特征峰的局部放大圖；
[0038] 圖9是圖2的27號(hào)到39號(hào)特征峰的局部放大圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] W下通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0040] 一、口炎清顆?？寡姿幮W(xué)檢測(cè)指標(biāo)的篩選。
[0041 ] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0042] 1.1實(shí)驗(yàn)藥品與試劑
[0043] 口炎清浸膏（廣州白云山和記黃捕中藥有限公司，批號(hào)：20140515),牛黃解毒片 (NP,北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號(hào)：13121398)，地塞米松(Dex，中國藥品 生物制品檢定所，批號(hào)：100129-201105 )，香煙（挪樹牌，廣東中煙工業(yè)有限公司），MTT (sigma，M2128-lG)，TNF-a、比-8、比-6、化-10 Elisa試劑盒（武漢優(yōu)爾生公司），RPMI-1640 培養(yǎng)基化yclone)。
[0044] 1.2實(shí)驗(yàn)儀器
[004引凈化工作臺(tái)：蘇州凈化安泰技術(shù)有限公司HT-840型;光學(xué)顯微鏡:Motic AE21;C02 培養(yǎng)箱:FORMA Seris 303792-6714型；超低溫冰箱:海爾BCD-568W;十萬分之一電子天平： Sartorius BP211D;電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公